Voies de signalisation WNT

par Patrick PLA, Université Paris-Saclay

La voie de signalisation Wnt joue un rôle très important dans le développement animal, le maintien des cellules souches (dans l’intestin par exemple) et la cancérogenèse (Nusse et Clevers, 2017). En 1982, le ligand Wnt1 a été initialement identifié chez les vertébrés comme un oncogène du cancer du sein, avant que l’on se rende compte qu’il s’agissait d’un orthologue de Wingless connu chez la drosophile pour son rôle dans la polarisation des segments selon l’axe antéro-postérieur. 90% des cancers colorectaux sont causés par des altérations génétiques des facteurs de la voie Wnt (Cancer Genome Atlas). Par conséquent, les inhibiteurs chimiques de la signalisation Wnt présentent un énorme potentiel thérapeutique.

Les Wnts sont conservés chez tous les animaux métazoaires. Chez les Mammifères, la complexité et la spécificité de la signalisation Wnt sont en partie causées par l’existence de 19 ligands Wnt. Ce sont des protéines riches en cystéine d’environ 350-400 acides aminés qui contiennent un peptide signal N-terminal qui permet leur sécrétion. Ces protéines subissent des modifications post-traductionnelles, notamment une palmitoylation qui est essentielle à leur bon fonctionnement. Les récepteurs des Wnt, Frizzled (FZD) possèdent sept domaines transmembranaires et sont aussi diversifiés : il en existe 10 chez les Mammifères.

Voie Wnt canonique

L’interaction entre le ligand Wnt, le récepteur Frizzled et le co-récepteur LRP5 ou LPR6 active la signalisation Wnt. Le principal résultat de l’activation de cette voie est la stabilisation de l’activateur transcriptionnel β-caténine. La voie est donc connue sous le nom de signalisation canonique Wnt ou Wnt/β-caténine.

La β-caténine a un domaine central d’environ 530 acides aminés formé de 12 répétitions en tandem de type armadillo (ARM) flanqué à chaque extrémité de régions désordonnées d’environ 100 acides aminés. Elle est non seulement impliquée dans la voie Wnt canonique mais elle est aussi associée au complexe liant les cadhérines au réseau d’actine. La coordination et la répartition entre ces deux fonctions est encore mal comprise.

*Voie canonique Wnt/β-caténine. (A) En l’absence de Wnt, la protéine d’échafaudage Axin avec APC, GSK3 et CK1 forment le complexe de destruction de la β-caténine. La β-caténine interagit avec le complexe et est phosphorylée par GSK3 et CK1α (CK1). La β-caténine phosphorylée est ubiquitinylée par SCFβ-Trcp et dégradée par le protéasome. Les niveaux de β-caténine restent donc faibles et la transcription dépendante de la β-caténine des gènes cibles Wnt/β-caténine est inhibée. (B) Wnt interagit avec les récepteurs Frizzled FZD et LRP6. Dishevelled (Dvl) est recrutée par Frizzled et interagit avec Axin. GSK3 et CK1γ liés à Axin phosphorylent les motifs PPPS/TP dans le domaine intracellulaire de LRP6. LRP6 phosphorylé se lie alors à Axin, ce qui inhibe l’activité kinase de GSK3. Cela provoque la dissociation et l’inactivation du complexe de destruction de la β-caténine, conduisant à la stabilisation de la β-caténine, à son entrée dans le noyau, à sa fixation aux facteurs de transcription LEF/TCF et à l’activation de la transcription des gènes cibles Wnt/β-caténine. (C) En cas de forte concentration de Wnt, Wnt induit la formation d’agrégats LRP6 d’une manière dépendante de Dishevelled (Dvl). Dans cette condition, FZD, Axin et GSK3 peuvent également s’agréger avec LRP6, générant des signalosomes LRP6. PIP2 est généré via PIP5K1 lié au Dvl. PIP2 accélère la formation des signalosomes LRP6 et la phosphorylation de LRP6, entraînant une activation supplémentaire de la signalisation Wnt/β-caténine. D’après https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.714330

En l’absence de Wnt, la protéine d’échafaudage Axin forme un complexe de destruction avec la protéine Adenomatous Polyposis Coli (APC), la glycogène synthase kinase 3β (GSK3β) et la caséine kinase 1 alpha (CK1α) qui se lie à la β-caténine cytoplasmique. Celle-ci est alors phosphorylée sur des sérines et des thréonines par CK1α et GSK3β. La β-caténine phosphorylée est ubiquitinylée par le complexe ubiquitine ligase SCFβ-Trcp E3, un processus qui la cible pour la dégradation par le protéasome 26S.

*La surexpression de GSK3β a un effet opposé à une suractivation de la voie Wnt. On injecte dans un des cellules d’un embryon de xénope au stade 2 cellules un ARNm codant Xwnt-1 (surexpression du ligand Wnt) ou GSK3β (surexpression de GSK3β). Une fois qu’ils ont atteint le stade neurula, on fixe les embryons que l’on traite en hybridation in situ pour suivre l’expression de gènes exprimés dans les crêtes neurales (Sox10 et Snail2). On constate qu’il y a une extension du territoire des crêtes neurales du côté (droit) où il y a suractivation de la voie Wnt, mais la surexpression de GSK3β a un effet inverse, suggérant que l’activité de GSK3β s’oppose à l’action de la voie Wnt. Une version commentée de cette figure est disponible en vidéo.
Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160603001611

**La mutation des sérines de la β-caténine que GSK3β phosphoryle abolit l’ubiquitinylation de la β-caténine. Des cellules Neuro2A (neuroblastome de souris) sont transfectées avec des vecteurs permettant l’expression de forme taguée myc de la β-caténine sauvage (β.His6, β.myc) et de forme taguée myc de β-caténine mutée (β.K19R, β.K49R, β.K19,49R (sites d’ubiquitination mutés, voir la séquence en bas), β.5SD (5 sérines qui sont des cibles de GSK3β transformées en aspartate) et β.4SA (4 sérines qui sont des cibles de GSK3β transformées en alanine). Les cellules sont traitées ou non par ALLN qui inhibe la dégradation par le protéasome permettant l’accumulation de protéines ubiquitinylées qui auraient dû être dégradées. Les extraits protéiques sont immunoprécipités par myc et le culot obtenu est analysé par un western-blot avec un anticorps anti-β-caténine. La grosse bande correspond à la β-caténine non ubiquitinylée et la bande juste au-dessus correspond aux formes ubiquitinylées. On constate que la mutation des sérines que cible GSK3β abolit toute forme d’ubiquitinylation de la β-caténine. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1170003/

L’ubiquitination (ou ubiquitinylation) des protéines est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important. L’ubiquitine qui est un petit peptide de 76 acides aminés (8,5 kDa) est attachée sur des lysines de la protéine cible par une cascade de trois enzymes : d’abord l’enzyme d’activation de l’ubiquitine E1 (UBA), puis une enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2 (UBC) et enfin une ligase d’ubiquitine E3.

*Ubiquitination de la β-caténine phosphorylée par GSK3β en absence de Wnt par l’ubiquitine E3-ligase SCF. Cette ubiquitine E3-ligase agit au sein d’un complexe avec E2 et des protéines régulatrices. Source : https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap7/co/module_Chap7_8.html

En présence de Wnt, Dishevelled se lie à un des domaines cytoplasmiques de Frizzled, puis le complexe de destruction de la β-caténine est recruté à la membrane plasmique par Dishevelled et LPRP5/6 et il est inactivé (Tauriello et al., 2012; Sharma et al., 2018).

*Dishevelled est recruté à la membrane plasmique par l’interaction Wnt/Frizzled. Des cellules de la coiffe animale de Xénopes injectés au préalable avec un ARNm permettant d’exprimer une protéine chimérique Dishevelled2-GFP (XDvl2-GFP, visible en vert) sont incubés in vitro en présence du ligand Wnt3a. A droite, les embryons avaient été en plus injectés avec un ARNm codant le récepteur Frizzled-7 alors qu’à gauche, les embryons avaient été en plus injectés avec des ARNm ne codant pas de protéines particulières. On remarque le changement de localisation de la fluorescence (donc de Dishevelled2) en présence de Wnt3a lorsque Frizzled-7 est exprimé. Barre d’échelle = 100 µm. Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1114802109

En conséquence, la β-caténine est stabilisée puis transloquée vers le noyau où elle se fixe sur les facteurs de transcription de la famille LEF/TCF. Ce complexe active l’expression de gènes cibles impliqués dans la prolifération cellulaire, la différenciation, l’auto-renouvellement des cellules souches et de nombreux autres processus biologiques.

Pour vous tester, vous pouvez faire cet exercice sur la β-caténine

La dérégulation de la signalisation Wnt provoque des troubles du développement et plusieurs maladies telles que le cancer (Nusse et Clevers, 2017). Notamment, l’hyperactivation de la β-caténine, due à des mutations de APC, de AXIN ou du CTNNB1 (gène codant la β-caténine elle-même), est un facteur de risque important du cancer du côlon (Bugter et al., 2021).

**Différentes manières avec lesquelles on a constaté des pertes de fonction ou d’expression d’APC dans les cellules cancéreuses. Une mutation peut aboutir à un codon STOP précoce et à une protéine APC tronquée, non fonctionnelle. Le promoteur du gène APC peut être hyperméthylé aboutissant à l’inhibition de son expression. Les facteurs de transcriptions inhibiteurs EZH2 et YY1 peuvent aussi être surexprimés ou encore les facteurs de transcription activateurs CDX2, CEBPZ, USF1/2 peuvent être sous-exprimés. Dans tous les cas, le complexe qui permet l’ubiquitinylation de la β-caténine qui provoque sa dégradation fonctionnera moins bien, aboutissant à une hyperactivation de la voie Wnt/β-caténine.Une version commentée de cette figure est disponible en vidéo.
Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.653222/full

LRP5 (ou LRP6) est un co-récepteur pour Wnt pour activer la signalisation Wnt/β-caténine (Pinson et al., 2000; Tamai et al., 2000; Wehrli et al., 2000). Le domaine extracellulaire de LRP5/6 interagit avec Wnt et, avec Frizzled, active la cascade de signalisation Wnt/β-caténine. La protéine Dishevelled (DVL) est essentielle pour l’agrégation de LRP5/6 avec Frizzled induite par Wnt. LRP5/6 avec un domaine extracellulaire tronqué est constitutivement actif et peut activer la signalisation Wnt/β-caténine indépendamment de Wnt (Liu et al., 2003). A l’inverse, LRP5/6 avec un domaine intracellulaire tronqué agit comme une forme dominante-négative, inhibant la signalisation Wnt/β-caténine (Tamai et al., 2000). Il existe cinq motifs PPPS/TP dans le domaine intracellulaire LRP6, et les résidus sérine/thréonine dans ces motifs sont phosphorylés lors de la stimulation Wnt (Tamai et al., 2004). GSK3β et CK1γ sont les principales kinases qui phosphorylent respectivement les motifs PPPS/TP et leurs régions flanquantes en présence du ligand Wnt (Davidson et al., 2005 ; Zeng et al., 2005). Cela montre le rôle dual de GSK3β et CK1γ qui par leur phosphorylation de LPR5/6 stimulent la voie canonique Wnt et par leur phosphorylation de β-caténine l’inhibent. La fixation du ligand Wnt permet le basculement du deuxième mode vers le premier mode.

**Un peptide mimant une forme phosphorylée de LPR6 est capable d’activer la voie canonique Wnt. Des embryons de xénope sont injectés dans la future région ventrale avec des peptides contenant un fragment de la séquence intracellulaire de LPR6 mutée de manière à la rendre inactive (A-mut) ou mutée de manière à mimer sa phosphorylation (introduction d’un acide aminé chargé négativement, Phos-A). On laisse les embryons se développer jusqu’au stade neurula et on quantifie la proportion d’embryons avec un double axe (indiquée par la tête de flèche rouge). On sait qu’une activation de la voie canonique Wnt dans la région ventrale provoque un double axe. De plus, par RT-PCR, on étudie l’expression de Xnr3, un gène activé par la voie Wnt (le témoin positif est un embryon injecté avec Wnt8; le témoin négatif une PCR sans qu’il y ait eu de réverse transcription (RT) au préalable). On observe un effet dose sur l’activation de l’expression de Xnr3 selon la quantité de Phos-A introduite. Source : https://journals.plos.org/plosone/article/figures?id=10.1371/journal.pone.0004926

Un autre acteur important dans le signalosome est PIP5K1, une phosphatidylinositol phosphate kinase dont l’activation est médiée par Frizzled et Dishevelled (Pan et al., 2008). L’activation de PIP5K1 conduit à la production de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (ptdIns(4,5)P2), qui à son tour induit l’agrégation et la phosphorylation de LRP6 (Pan et al., 2008). Par conséquent, les composants non protéiques tels que les phospholipides jouent également un rôle crucial dans la signalisation Wnt/β-caténine médiée par LRP6.

Le résultat final de l’activation de la cascade de signalisation Wnt est un échappement de la β-caténine de son complexe de destruction, lui permettant de s’accumuler dans le cytoplasme puis de se déplacer vers le noyau (Cselenyi et al., 2008; Wu et al., 2009). Une fois dans le noyau, β-caténine ne se fixe pas directement à l’ADN et ne peut ainsi pas être considéré comme un facteur de transcription. Elle va interagir avec des facteurs de transcription TCF/LEF qui, eux, se fixent à l’ADN au niveau de séquences-cibles. Les facteurs TCF/LEF inhibent la transcription des gènes cibles en l’absence de signal Wnt. Après stimulation cellulaire par les ligands Wnt, l’accumulation de la β-caténine dans le noyau déloge un corépresseur transcriptionnel appelé Groucho de la liaison avec TCF (Arce et al., 2009 ; Daniels et Weis, 2005).

**A la recherche des domaines de LEF-1 qui se lient à Groucho. A) Des billes de glutathion liées avec GST-Groucho (panneau du milieu) ou GST (panneau du bas) ont été testées pour l’interaction avec des constructions de LEF-1 contenant diverses délétions traduites in vitro et marquées au 35S (le résultat des différentes traductions est montré dans le panneau du haut) . B) Les délétions N-terminales de LEF-1 1-234 et 1-191 (pistes 2 et 3) n’ont pas pu interagir avec GST-Groucho. LEF-1 1-256 (piste 1) interagit fortement avec Groucho mais un mutant de délétion dépourvu d’un domaine appelé CRD mais conservant un domaine appelé HMG (Δ110-295, piste 4) interagit faiblement. Un contrôle négatif GST montre que LEF-1 n’interagit pas avec GST ou les billes. Gel SDS-PAGE coloré au Coomassie de GST-Groucho purifié (piste 1) ou de GST seul (piste 2). C) Alignement des acides aminés de la séquence putative de liaison de Groucho (GBS) et des séquences flanquantes dans LEF-1 et d’autres membres humains de la famille LEF/TCF ainsi que les orthologues de la drosophile (Pan = la protéine Pangolin) et de C. elegans (POP-1). Source : https://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2407-9-159

Les mutations dans TCF7L2 qui code TCF4 sont impliquées dans de nombreux types de cancers et elles favorisent la migration et l’invasion des cellules cancéreuses colorectales humaines. Parmi les cibles de β-caténine/LEF-TCF on trouve l’oncogène c-Myc et aussi la cycline D1 qui est impliquée dans la progression à travers la phase G1 du cycle cellulaire vers la phase S.

Dans les embryons de vertébrés, les quatre homologues du TCF sont fonctionnellement spécialisés. Alors que certains membres de la famille TCF, tels que LEF1, sont nécessaires pour l’activation de la transcription (Arce et al., 2006 ; Galceran et al., 1999), TCF3 réprime de nombreux gènes (Cole et al., 2008; Houston et al., 2002 ; Kim et al., 2000). Le poisson zèbre déplété en TCF3 présente un défaut crânien antérieur, qui peut être sauvé par un forme constitutive répresseur du TCF3 (Kim et al., 2000).

**Le mutant de poisson zèbre headless (uninjected) qui a une mutation perte-de-fonction de Tcf3 ne peut être sauvé que par l’expression d’une forme constitutivement répressive de Tcf3 (domaine de fixation à l’ADN de Tcf3 fusionné au domaine répresseur de Engrailed (Eng)). Le mutant n’est pas sauvé par l’expression d’une forme de Tcf3 constitutivement activatrice de la transcription (VP16-Tcf3). Source

Des expériences de perte de fonction sur le xénope révèlent les rôles opposés de la β-caténine et de TCF3 dans la spécification des axes dorsoventral et antéropostérieur (Houston et al., 2002 ; Liu et al., 2005).

Semblable aux embryons de Xenopus appauvris en TCF3, les souris mutantes pour le gène Tcf3 présentent un mésoderme axial élargi et une perte de tissus nerveux antérieurs; ces défauts peuvent être en grande partie sauvés par l’expression d’une construction TCF3 répressive dépourvue du domaine d’interaction avec la β-caténine (Merrill et al., 2004). Ainsi, TCF3 est un cas particulier parmi les facteurs LEF/TCF et joue le rôle d’inhibiteur de la voie Wnt.

Signalons que β-caténine ne se fixe pas qu’à des facteurs LEF/TCF mais aussi à d’autres protéines formant un véritable centre d’activation transcriptionnel.

**Domaines de la β-caténine et les protéines avec lesquelles elle interagit. La β-caténine possède de multiples partenaires de liaison nucléaire qui jouent un rôle essentiel dans l’activation des gènes cibles de la voie Wnt. TCF/LEF sert de facteur de liaison à l’ADN pour le complexe d’activation transcriptionnelle, tandis que BCL9/BCL9-2 forme un échafaudage pour d’autres facteurs nécessaires pour activer la transcription dépendante de Wnt. Lors de la translocation de la β-caténine vers le noyau, la chromatine associée aux éléments de réponse aux Wnt est altérée pour favoriser l’activation des gènes cibles via le recrutement de complexes de remodelage des histones médiée par la β-caténine. Les histones acétyltransférases, comme CBP/p300, acétylent les nucléosomes associés aux éléments de réponses aux Wnt, favorisant ainsi la transcription des gènes. Un autre remodeleur de la chromatine, SET-1, qui est une histone méthyltransférase, ajoute des groupes méthyle à la lysine 4 de l’histone 3 (H3K4me), une marque associée à une transcription active. Source : https://www.mdpi.com/2073-4425/11/8/886/pdf

Voies Wnt non canoniques

Dishevelled est un composant de la voie Wnt-Wingless qui est impliqué à la fois dans la voie canonique et dans les voies non canoniques. Initialement, Dishevelled a été appelé ainsi à cause du mutant perte-de-fonction chez la drosophile où les soies présentes à la surface de l’aile sont désorientées (et non pas alignées les unes par rapport aux autres comme d’habitude) ce qui indique un problème de polarité cellulaire planaire.

La polarité cellulaire planaire (PCP) fait référence à la polarisation collective des cellules le long d’un plan tissulaire, typiquement dans un tissu épithélial sur un plan perpendiculaire à l’axe apico-basal. Elle est contrôlée par un ensemble conservé de protéines associées à la membrane connue sous le nom de voie PCP centrale (Yang et Mlodzik, 2015; Strutt et al., 2016; Butler et Wallingford, 2017). La voie PCP dirige un large éventail de comportements cellulaires polarisés dans une grande variété de tissus, notamment les battements ciliaires dirigés, la motilité cellulaire collective et l’alignement des soies à la surface de la cuticule des Insectes et des poils sur la surface de la peau des Mammifères (Niessen et al., 2012; Devenport, 2014; Davet et al., 2017).

*Effet d’un mutant d’un gène codant une protéine de la voie Wnt/PCP sur l’orientation des soies de l’aile de drosophile. Normalement, les soies à la surface de l’aile de la drosophile sont tous alignés, indiquant une polarité planaire de l’épithelium épidermique. A gauche, chez le mutant perte-de-fonction strabismus (stbm), on observe une orientation désordonnée des soies. L’expression par transgénèse d’un gène stbm sauvage (couplé au gène codant YFP pour des études de localisation non montrées ici) chez le mutant rétablit le phénotype sauvage. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/130/13/3007/41971/Strabismus-is-asymmetrically-localised-and-binds

La voie de la PCP est essentielle au développement embryonnaire, et la perturbation génétique de la PCP entraîne de graves anomalies du développement, notamment des anomalies du tube neural et des cardiopathies congénitales (Curtin et al., 2003 ; Phillips et al., 2007 ; Wang et al., 2019). La voie de la PCP est aussi impliquée dans la mise en place de la polarité neuronale et dans le guidage axonal (He et al., 2018) et également dans la tumorigenèse (Zhan et al., 2016).

La PCP requiert les fonctions de plusieurs protéines centrales conservées, Prickle, Van Gogh/Strabismus (ou Vangl), Dishevelled (Dvl), Frizzled (Fzd) et Flamingo/Stan, identifiées à l’origine dans des études génétiques chez la drosophile. Dans les tissus épithéliaux de la drosophile, la PCP se manifeste par la distribution des complexes membranaires Frizzled/Dishevelled et Prickle/Van Gogh dans des domaines opposés à l’intérieur de chaque cellule (Adler, 2012; McNeill, 2010; Peng et Axelrod, 2012).

*Établissement de la polarité cellulaire planaire. La polarité cellulaire planaire (PCP) correspond à l’organisation des cellules sur un plan orthogonal à l’axe apical-basal d’un épithélium. La PCP est établie par une distribution asymétrique des complexes avec les complexes Vangl-Pk et Fzd-Dvl qui se localisent sur les côtés opposés de la cellule. La polarité cellulaire est maintenue et propagée aux cellules voisines par le biais d’interactions intercellulaires protéine-protéine entre complexes opposés et d’interactions homophiles entre Fmi/Celsr. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.887100/full

**Voie Wnt/PCP. Lors de la signalisation Wnt/PCP, les ligands Wnt se lient au complexe récepteur Frizzled (associé à ROR1/2) pour recruter et activer Dvl/Dishevelled. Dvl par désinhibition de la protéine cytoplasmique DAAM1 active la petite GTPAse Rho. qui active ROCK (Rho kinase). La petite GTPase Rac active JNK. Cela conduit à des réarrangements du cytosquelette et/ou à des réponses transcriptionnelles via par exemple ATF2. Le complexe VANGL(ou Van Gogh-Like)/PRICKLE agit comme un inhibiteur de la voie Wnt/PCP en empêchant le recrutement de DVL/Dishevelled Par Frizzled. CELSR/Fmi joue un rôle dans les interactions homophiliques avec les CELSR/Fmi des cellules voisines et est associé avec les 2 complexes (Fz/Dsh et Vangl/PRICKLE). Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6829399/pdf/cells-08-01198.pdf

Le complexe Frizzled/Dishevelled induit une cascade de signalisation médiée par la voie non canonique qui provoque l’activation des petites GTPases Rho et Rac qui contrôlent l’arrangement du cytosquelette et notamment des microfilaments d’actine (Fanto et al., 2004; Habas et al., 2001).

Wnt5a est un ligand activant la voie PCP. Il interagit avec la région extracellulaire de LRP6 et cette interaction inhibe l’activation de Rac1, une protéine cible de la signalisation Wnt non canonique (Bryja et al., 2009). De plus, Wnt5a interfère avec l’interaction entre Wnt3a et LRP6, entraînant également l’inhibition de la signalisation Wnt/β-caténine (Bryja et al., 2009; Grumolato et al., 2010).

Le mécanisme moléculaire du choix de l’activation de la voie canonique ou d’autres voies après fixation du ligand WNT à ses récepteurs est encore mal compris. On sait que parmi les 19 ligands Wnt identifiés chez les Mammifères, certains d’entre eux, Wnt1, Wnt3a et Wnt8, activent préférentiellement Wnt/β-caténine tandis que d’autres, Wnt5a et Wnt11, activent principalement la voie Wnt/PCP. Ror1/2 est un récepteur tyrosine kinase qui a un domaine extracellulaire riche en cystéine de type Frizzled et il est un co-récepteur impliqué dans la réception du signal Wnt pour activer la voie PCP. Le choix des voies canonique ou PCP se fait sans doute par des affinités différentielles entre LPR5/6 et Ror1/2.

De manière intéressante, la localisation du facteur de transcription GRHL3 détermine le passage de la voie Wnt canonique à la voie Wnt/PCP au cours du développement. Lorsqu’il est dans le noyau, GRHL3 favorise l’activité de la voie Wnt/β-caténine qui accompagne la détermination de l’épiderme à partir de l’ectoderme et lorsqu’il passe dans le cytoplasme, GRHL3 stimule la voie Wnt/PCP qui intervient dans la morphogenèse de l’épithélium épidermique et dans sa polarité (Kimura-Yoshida et al., 2022).

***Rôle de la localisation de GRHL3 et de son action sur les voies Wnt lors de la formation de l’épiderme. GRHL3 exerce deux fonctions différentes liées à la détermination de l’épiderme et à la morphogenèse de cet épithélium au cours du développement . La première fonction est médiée par GRHL3 nucléaire en tant que facteur de transcription en aval de la β-caténine. La deuxième fonction est médiée par GRHL3 cytoplasmique impliquant la voie Wnt non canonique, qui contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP). La voie Wnt non canonique facilite la formation des fibres d’actomyosine et modifie par conséquent les propriétés physiques telles que la rigidité mécanique des cellules nécessaires à la morphogenèse épithéliale. SE = Ectoderme de surface, NE = Ectoderme neural. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-018-06171-8

Le syndrome de Robinow est une maladie génétique causant des malformations squelettiques, génitales et rénales. Il y a une grande variété de génotypes aboutissant à ce syndrome mais toutes les mutations découvertes résident dans des gènes de la voie de signalisation Wnt non canonique, notamment ROR2, WNT5A et aussi DVL1 (Dishevelled1) et DVL3 (Person et al., 2009). Ces données soutiennent l’hypothèse selon laquelle le syndrome de Robinow résulte d’une perturbation de la voie Wnt/PCP. Les défauts cranio-faciaux observés chez les patients et l’expression de ROR2 lors de la spécification et de la migration des crêtes neurales céphaliques qui forment une bonne partie du squelette cranio-facial sont sans doute liés (Schille et al., 2016).

***Analyse phénotypique des sujets porteurs de mutations pathogènes dans les gènes DVL1 (Dishevelled1), DVL3, FZD2, WNT5A et NXN liés au syndrome de Robinow. La prévalence est présentée sur une échelle de 0 à 1 (1 correspondant à 100% des patients avec le symptome considéré). Dans la « carte thermique » (heatmap), le noir indique une prévalence plus élevée, tandis que la couleur pêche clair indique une prévalence plus faible ; le gris clair indique que ces données spécifiques ne sont pas disponibles. Les phénotypes sont classés par ordre de prévalence décroissante globale. On observe que selon les gènes ayant été mutés, certains symptomes sont très répandus parmi les patients, d’autres moins, ce qui montre que bien que la voie Wnt/PCP soit altérée dans chaque cas, elle l’est de manière différente selon les gènes mutés et aussi selon la localisation dans le corps. Source : https://www.cell.com/hgg-advances/fulltext/S2666-2477(21)00055-5

Une autre voie non canonique aboutit à l’augmentation de la concentration de Ca²⁺ dans le cytoplasme. Les Wnt se fixent alors au co-récepteur tyrosine kinase Ryk. Chez la drosophile, l’orthologue de Ryk, Derailed, est impliqué dans la répulsion des axones en croissance par Wnt5 (Yoshikawa et al., 2003).

**Voie de signalisation Wnt/Ca²⁺. L’activation de la voie Wnt/Ca²⁺, une voie indépendante de la β-caténine, entraîne la libération de Ca²+ du réticulum endoplasmique (ER), qui active les protéines kinases CAMKII et PKC. Cette voie déclenche des événements en aval avec notamment l’activation des facteurs de transcription NFκB et CREB et la transcription de leurs gènes-cibles en aval. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.692888/full

Contrôle de la sécrétion et de la diffusion des Wnt

La molécule de drosophile Wingless (Wg) est la molécule de la famille WNT la plus étudiée in vivo (Hausmann et al., 2007). Ces études ainsi que les travaux sur C. elegans ont identifié des gènes qui régulent la biogenèse des Wnt et leur sécrétion. Le gène Porcupine code une protéine transmembranaire du RE (Reticulum Endoplasmique) qui contient un domaine O-acyl transférase, qui a un rôle dans la modification post-traductionnelle de Wg impliquant un transfert d’acyl qui aboutit à une palmitoylation (ou palmitylation) (Hausmann et al., 2007). Une déplétion de Porcupine entraîne une diminution de la palmitoylation de Wg et WNT3A sur la sérine 209 et une accumulation de Wg et de WNT3A dans le RE qui aboutit à une diminution de leur sécrétion (Takada et al., 2006).

Deux autres complexes protéiques qui contrôlent la sécrétion de Wnt/Wg ont été identifiés. Wntless (Wls), également connue sous le nom de Evenness interrupted (Evi) ou Sprinter (Srt), chez la drosophile, et le complexe rétromère chez les nématodes (Hausmann et al., 2007). Les mutants porcupine, wls et retromer phénocopient les mutant Wg/Wnt mutants chez la drosophile et C. elegans, attestant de leurs rôles essentiels dans la biogenèse Wnt.

Wls est une protéine à plusieurs domaines transmembranaires localisée dans l’appareil de Golgi, les compartiments endocytaires et la membrane plasmique et est essentielle pour la sécrétion de Wg.

Le complexe rétromère, composé de cinq sous-unités, a d’abord été étudié chez la levure. Il médie le trafic membranaire des protéines entre les endosomes et l’appareil de Golgi (Hausmann et al., 2007).

***Structure du complexe rétromère qui permet de récupérer et recycler Wls, une protéine nécessaire à la sécrétion de Wingless/Wnt. Ce complexe assure le transfert des protéines des endosomes à l’appareil de Golgi. Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9trom%C3%A8re#/media/Fichier:Retromer_protein_complex.png

Le complexe rétromère est requis pour la récupération/le recyclage des Wls de l’endosome au Golgi (Belenkaya et al., 2008 ; Franch-Marro et al., 2008 ; Pan et al., 2008 ; Port et al., 2008), qui est probablement médiée par une interaction directe entre Wls et la sous-unité du rétromère Vps35. La perte de fonction du rétromère provoque la dégradation de Wls dans les lysosomes et aboutit à la réduction de la sécrétion de Wls et donc de Wg/Wnt. Ces études ont conduit au modèle suivant : Wnt est glycosylé et ses résidus lipidiques sont modifiés par Porcupine, et il est escorté par Wls du Golgi à la membrane plasmique pour la sécrétion. Wls est recyclé par endocytose et renvoyé au Golgi par le complexe rétromère.

La visualisation des ligands Wnt est essentielle pour comprendre leur distribution. Dans le disque alaire de la drosophile, les protéines Wg sont largement distribuées à partir des cellules marginales des ailes, où Wg est exprimé (Strigini et Cohen, 2000; Zecca et al., 1996). En outre, la dispersion à longue distance de Wg a été mise en évidence par une expérience dans laquelle Wg a été capturé par Frizzled2 (un de ses récepteurs) exprimé de manière distale (Chaudhary et al., 2019). De même, les ligands Wnt endogènes marqués avec des protéines fluorescentes ont montré des distributions à longue distance chez C. elegans (Pani et Goldstein, 2018).

*Gradient de la protéine Wnt marquée avec un tag fluorescent observé chez Caenorhabditis elegans. Projection d’intensité maximale de la fluorescence Wnt/EGL-20::YPET chez un ver vivant au stade tardif L1 illustrant le gradient antéropostérieur de Wnt coloré ; (f) tracé de profil de l’intensité de fluorescence Wnt/EGL-20::YPET antéropostérieur dans le même ver qu’en (e); (g) projections d’intensité maximale d’un animal vivant au stade intermédiaire L1 montrant des membranes plasmiques de cellules sources de Wnt marquées par Pegl-20>2x mKate2::PH (magenta) et Wnt/EGL-20::mNG protéine (vert) ; (h) tracé de profil des intensités de fluorescence normalisées EGL-20::mNG et Pegl-20> 2x mKate2::PH le long de l’axe antéropostérieur illustrant la dispersion de Wnt à partir des cellules sources. L’orientation des animaux est indiqué (head=tête, tail = queue). Barres d’échelle = 20 µm. Source : https://elifesciences.org/articles/38325

En plus de ces observations chez les invertébrés, les ligands Wnt8 endogènes se dispersent loin de leurs cellules sources dans les embryons de Xenopus (Mii et al., 2017). D’autre part, chez la souris, Wnt3 s’accumule à quelques diamètres de cellules de ses cellules sources dans le microenvironnement de l’intestin (Farin et al., 2016). Ces études montrent que les ligands Wnt se dispersent bien dans les tissus et les embryons, bien que la plage de dispersion varie.

Les molécules de surface cellulaire, par exemple les protéoglycanes de sulfate d’héparane (HS) (HSPG), ont également un rôle important dans la distribution et la signalisation de Wnt. Les HSPG se composent d’une protéine centrale et de plusieurs chaînes de glycosaminoglycane HS (GAG). Parmi les HSPG, la protéine centrale glypicane et les chaînes HS sont nécessaires à la distribution et à la signalisation de Wg chez la drosophile.

*Les protéoglycanes d’héparane sulfates sont nécessaires à la signalisation Wnt chez la drosophile. Observation de la cuticule d’un embryon de drosophile sauvage (A) et d’un embryon muté sugarless (B) qui présente un défaut de synthèse des HSPG (héparane sulfate protéoglycanes). Le phénotype obtenu est un défaut de polarité segmentaire similaire à celui qui est obtenu lorsque la signalisation wingless est défectueuse. Une version commentée de cette figure est accessible en vidéo.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/124/18/3565/39459/The-Drosophila-sugarless-gene-modulates-Wingless

Antagonistes et agonistes naturels et synthétiques de la voie Wnt

**Mécanismes d’inhibition de la signalisation Wnt. (A,B) La liaison de Dkk1 à LRP6 perturbe la formation du complexe Frizzled (Fz)-LRP6 induite par Wnt (A) et/ou induit l’endocytose de LRP6 en présence de son corécepteur Kremen (Krm) (B). (C) sFRP, WIF-1 et Cerberus séquestrent Wnt avant qu’il ne se fixe à son récepteur, inhibant ainsi la signalisation Wnt canonique et non canonique. (D) Les sFRP peuvent également inhiber la signalisation Wnt canonique et non canonique en se liant à Fz. (E) La liaison de Wise/SOST à LRP6 bloque la formation de complexes Fz-LRP6 induite par Wnt. (F) IGFBP-4 se lie à LRP6 et Fz, empêchant ainsi la transduction du signal par Wnt. Source : http://m.cshperspectives.cshlp.org/content/5/3/a015081.long?view=long&pmid=23085770

*La protéine Cerberus inhibe trois voies de signalisation dont la voie Wnt. Nommée d’après le chien à trois têtes qui gardes les Enfers selon la mythologie gréco-romaine pour sa capacité à former des têtes ectopiques lorsqu’elle est surexprimée, cette protéine inhibe trois voies de signalisation : Wnt, BMP et Nodal.

Cerberus est nécessaire à la formation de la tête chez les vertébrés. De même que Dkk1 ou Dickkopf-1 qui est un ligand de haute affinité pour LRP6, le co-récepteur de Wnt (aux côtés de Frizzled). La fixation de Dkk1 empêche Wnt d’interagir avec LRP6 et donc Dkk-1 est un antagoniste de la voie Wnt (Mao et al., 2001 ; Semenov et al., 2001; Bafico et al., 2001). Au début du développement des vertébrés, Dkk1 est exprimé dans l’endomesoderme antérieur et joue un rôle important dans la mise en place de l’axe antéro-postérieur en inhibant la signalisation Wnt/LRP6 dans l’organisateur de la tête et la plaque précordale (Glinka et al., 1998 ; Hashimoto et al., 2000 ; Shinya et al., 2000 ; Mukhopadhyay et al., 2001).

Les autres récepteurs de Dkk sont les protéines transmembranaires Kremen1 et 2 (Krm1 et 2, appelés collectivement Krms). Dkk1 forme un complexe ternaire complexe avec Krm1 ou 2 et LRP6, qui est éliminé de la surface de la cellule par endocytose, arrêtant ainsi la transduction du signal Wnt (Mao et al., 2002). Chez le Xénope, Krms et Dkk1 sont co-exprimés dans la plaque précordale et coopèrent fonctionnellement dans l’inhibition de Wnt pour réguler la mise en place de l’axe antéro-postérieur dans le tube neural (Davidson et al., 2002). Krm1 est aussi nécessaire à la formation du thymus chez la souris en agissant comme inhibiteur de Wnt (Osada et al., 2006).

*Kremen1 diminue la transcription des gènes cibles de la voie canonique Wnt/β-caténine. Le gène rapporteur luciférase se trouve sous le contrôle d’un promoteur avec des sites de fixation pour LEF/TCF (système TopFlash). Cette construction est transfectée dans des cellules épithéliales du thymus provenant de souris sauvages (WT) ou Krm1-/- (KO) et l’activité luciférase est mesurée. Source : https://www.hindawi.com/journals/jir/2006/602150/

Dans les embryons de xénope, Krm2 est exprimé dans diverses régions qui n’expriment pas Dkk1 (Davidson et al., 2002), notamment dans les cellules de crêtes neurales. L’expression de Krm2 est activée par Wnt et est requis pour la formation des crêtes neurales. Dans ce cas, en absence de Dkk1, Krm2 stimule la signalisation Wnt et favorise, via une liaison directe, la localisation à la surface cellulaire de LRP6. Ces résultats montrent que Krms agit comme inhibiteur ou activateur de la signalisation Wnt en fonction de la présence ou de l’absence de Dkk.

Bighead est un autre antagoniste de la voie Wnt. Il ressemble dans son mode d’action à Dkk. Il est produit par l’organisateur de Spemann et se fixe sur LPR6 ce qui aboutit à son endocytose et donc à l’absence de possibilité pour Wnt d’activer correctement ses cellules cibles (Ding et al., 2018). Comme pour Dkk, son action est nécessaire pour qu’une tête normale se forme. Attention, parfois l’endocytose peut au contraire stimuler la voie Wnt comme c’est le cas dans les cellules de crêtes neurales (Piacentino et al., 2022).

*L’endocytose est nécessaire à une bonne activation de la voie canonique Wnt/β-caténine dans les cellules de crêtes neurales. Le futur tube neural d’embryons de poulet est électroporé avec une construction permettant d’exprimer un dominant-négatif de la dynamine sous le contrôle d’un promoteur spécifique des crêtes neurales, ce qui bloque l’endocytose dans les cellules. En haut, à gauche, on réalise une immunofluorescence sur une coupe transversale d’embryon électroporé avec un anticorps reconnaissant Pax7 (vert) et la dynamine mutée (rose) (la dynamine ne s’exprime que d’un seul côté, l’autre sert de témoin). En bas, à gauche, Un gène rapporteur exprimant une histone couplée à la GFP est sous le contrôle de LEF/TCF et permet de mesurer l’activité de la voie Wnt. On quantifie la différence de fluorescence de GFP entre le côté où l’endocytose a été bloquée et le côté témoin. Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2212879119

Les protéines sécrétées Frizzled-related (sFRP) dont Frzb se lient à Wnt et l’empêchent d’activer ses récepteurs. Cela joue un rôle dans de nombreux processus développementaux, par exemple la mise en place de l’épithélium stomacal et intestinal.

*Les sFRP inhibent la signalisation Wnt. Coupes transversales d’intestins de souris à E13,5 traitées en immunofluorescence avec un anticorps reconnaissant Phospho-c-Jun. On distingue l’épithélium (au centre) et le mésenchyme (Me). Wnt5a active ici la phosphorylation de c-Jun (observez qu’il y a moins de signal fluorescent chez les souris Wnt5a^-/-) et il le fait par une voie non canonique. Lorsque plusieurs gènes codant des SFRP sont invalidés, la phosphorylation de c-Jun est plus importante dans l’épithélium et aussi dans le mésenchyme. Comme le montrent d’autres expériences, l’inhibition de la signalisation Wnt par les sFRP joue ici un rôle important dans l’orientation des divisions des cellules de l’épithélium intestinal et dans la mise en place de leur polarité apico-basale. Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000427

Autres antagonistes de la voie Wnt, les ligases E3 transmembranaires ZNRF3/RNF43 qui ubiquitinylent et provoquent l’internalisation et la dégradation de Frizzled et de LRP6. ZNRF3/RNF43 sont activés par la voie de signalisation Wnt elle-même ce qui montre qu’il s’agit d’une boucle de rétroaction négative (Koo et al., 2012).

*RNF43 induit l’internalisation et la dégradation de Frizzled. Localisation subcellulaire de SNAP–Frizzled5 (FZD5) dans des cellules HEK293T co-transfectées avec un contrôle ou RNF43. La protéine de surface SNAP–FZD5 a été marquée avec SNAP–Alexa549 pendant 15 min et chassée pendant 5 min. Notez que RNF43 induit une internalisation rapide de SNAP–FZD5. Barres d’échelle = 10 μm. Source : https://www.nature.com/articles/nature11308

Des mutations perte-de-fonction de ZNRF3/RNF43 sont observées dans 5 à 10% des cancers pancréatiques, aboutissant à une suractivation de la voie Wnt (Jiang et al., 2013).

Les ligands R-spondine se fixent sur leur récepteur LGR4/5/6 et séquestrent ZNRF3/RNF43, conduisant à la clairance membranaire de ZNRF3/RNF43 (Carmon et al., 2011 ; Glinka et al., 2011 ; Koo et al., 2012). Ainsi, les R-spondines augmentent l’abondance membranaire des récepteurs Wnt et potentialisent la signalisation Wnt.

LGR5 est une protéine intéressante. Son gène a été identifié initialement comme une cible de la voie Wnt dans les cellules souches intestinales (elle est un marqueur classique qui permet d’identifier ces cellules). C’est une protéine à 7 domaines transmembranaires de la famille des rhodopsines. Le fait que ce soit un récepteur de la R-spondine qui potentialise la signalisation Wnt montre qu’une boucle de rétroaction positive est à l’œuvre dans les cellules souches de l’intestin (de Lau et al., 2014)

**Régulation de la disponibilité des récepteurs Wnt sur les cellules souches. (A) Lors de la liaison de Wnt au complexe récepteur Fz/LRP, quelque 100 gènes cibles Wnt sont activés, y compris Lgr5. Deux autres gènes cibles Wnt, Rnf43 et Znrf3, codent pour des ligases E3 transmembranaires contenant un domaine RING cytoplasmique. Ceux-ci servent de composants d’une boucle de rétroaction négative. (B) L’interaction enzymatique du domaine RING associé à Rnf43/Znrf3 avec le complexe Fz/LRP conduit à une polyubiquitination des boucles intracellulaires du domaine 7TM de Fz. (C) L’endocytose résultante de Fz/Lrp inhibe la signalisation Wnt. On ne sait pas si Rnf43/Znrf3 sont endocytosés avec le complexe récepteur Wnt ou se séparent après leur action. Lorsque la R-spondine est présente (D), elle est recrutée par Lgr5 ou son homologue, Lgr4 (E). Cela permet ensuite à la R-spondine d’interagir avec Rnf43/Znrf3 (E), entraînant la clairance membranaire de ce dernier (F). En conséquence, les complexes récepteurs Wnt/Fz/Lrp persistent sur la membrane plasmique, améliorant la force et la durée du signal Wnt. Source : http://genesdev.cshlp.org/content/28/4/305.full.html

Notum est un autre inhibiteur de la voie Wnt et il agit sous la forme d’une boucle de régulation négative car sa sécrétion est activée par la voie Wnt. Il agit en tant que carboxyestérase et il dépalmitoyle Wnt (Kakugawa et al., 2015). La palmitoylation est nécessaire à la fixation de Wnt à Frizzled donc cela inhibe la réception du signal Wnt.

**Dépalmitoylation de Wnt par Notum aboutissant à une inhibition de l’interaction de Wnt avec son récepteur Frizzled. Source : https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jmedchem.0c01974

De nombreux petites molécules chimiques inhibitrices ou activatrices de la voie Wnt ont été découvertes ces dernières années. Elles sont importantes pour manipuler la voie Wnt, notamment dans les protocoles de différenciations des cellules souches pluripotentes mais aussi pour développer des traitements anti-cancéreux (Bayle et al., 2021).

***Bilan des petites molécules agissant sur la voie Wnt. Il faudrait ajouter CHIR99021 qui est un inhibiteur de GSK3beta et donc un activateur de la voie Wnt. Source : https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.jmedchem.0c01974

Signalons qu’une voie de signalisation chez les végétaux ressemble à la voie Wnt : la voie activée par les brassinostéroïdes. En absence de ligand, un orthologue de GSK3 appelé BIN2 phosphoryle un co-facteur de transcription appelé BZR1 (qui n’a rien à voir évolutivement avec la β-caténine) et l’empêche de s’accumuler dans le noyau. La fixation d’un brassinostéroïdes rend BIN2 inactif et permet à BZR1 de s’accumuler dans le noyau et de réguler la transcription. Cette voie joue un rôle dans l’élongation des cellules et aussi du tube pollinique et pour la différenciation des faisceaux vasculaires.

***Voie de signalisation des brassinostéroïdes (hexagone rouge sur le schéma). Une voie de signalisation végétale qui ressemble à la voie canonique Wnt/β-caténine avec l’intervention d’un orthologue de GSK3. Source : https://www.biorxiv.org/content/10.1101/351056v1.full

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