La fécondation

Par Patrick Pla, Université Paris-Saclay

SOMMAIRE : La rencontre des gamètes ; Contact et fusion entre les gamètes ; Conséquences de la fécondation ; La procréation médicalement assistée

Notre corps a un temps de vie limité mais la reproduction permet à l’espèce de se perpétuer. Ce sont les cellules de la lignée germinale (les gamètes) qui réalisent la reproduction sexuée. La fécondation correspond à la rencontre entre le gamète mâle (spermatozoïde) et le gamète femelle (ovocyte). Il s’agit de deux cellules très différentes : l’une est très mobile, l’autre l’est peu et son cytoplasme formera le cytoplasme du zygote issu de la fusion des deux cellules. Pour souligner cette différence, on parle d’anisogamie. Des mécanismes de reconnaissance et d’activation mutuelle permettent à ces cellules d’interagir, de fusionner et de mettre en commun leur matériel génétique. Les gamètes sont des cellules haploïdes ; leur fusion permet de rétablir la diploïdie habituelle des animaux.

Des dysfonctionnements dans la reproduction touchent 1 couple sur 10 en France et des solutions thérapeutiques d’assistance médicale à la procréation se sont développées à partir du début des années 1980s.

La rencontre des gamètes

La fécondation est externe chez les anoures tels que le xénope, avec néanmoins un accouplement qui s’appelle un amplexus. Le mâle maintient la femelle avec ses membres antérieurs et émet ses spermatozoïdes en même temps que les ovocytes sont émis du cloaque de la femelle. Cela permet de concentrer sur un espace limité et dans le temps la présence des gamètes mâles et femelles, ce qui optimise les rencontres entre les deux et limite les pertes.

Les spermatozoïdes entrent en contact avec la gangue gélatineuse qui entoure la masse des ovocytes et cette interaction est nécessaire au bon déroulement de la fécondation.

Chez les Mammifères, après l’éjaculation, les spermatozoïdes passent le col de l’utérus en traversant la glaire cervicale dont le passage est facilité autour de la période d’ovulation sous le contrôle du pic d’œstrogènes (mailles plus larges, pH moins acide). Chez l’Homme, seuls 2 millions de spermatozoïdes sur les 60 millions éjaculés traversent cette barrière.

*Schéma d’un spermatozoïde humain. La tête fait environ 5 µm et le flagelle fait 50 µm. Source : https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e0/Complete_diagram_of_a_human_spermatozoa_fr.svg

La nage flagellaire n’est pas le paramètre principal qui explique le déplacement des spermatozoïdes (on trouve des spermatozoïdes dans l’oviducte 30 min après éjaculation, ce qui est trop court pour que ce soit la seule mobilité flagellaire qui soit impliquée). Ce sont les contractions vaginales et utérines (contrôlées par les muscles lisses) qui les amènent vers l’oviducte. Ces contractions sont sous le contrôle de l’ocytocine dont la sécrétion est stimulée par l’accouplement. Les contractions utérines sont facilitées par les œstrogènes dont la concentration sanguine est maximale autour de la période de l’ovulation.  

Un spermatozoïde éjaculé ne pourra pas directement féconder un ovocyte. Des modifications induites par les voies génitales femelles (utérus et surtout oviducte) doivent avoir lieu. C’est la capacitation. Les propriétés membranaires sont alors modifiées : perte de cholestérol membranaire, concentration à l’avant de l’acrosome des radeaux lipidiques membranaires importants pour la fécondation. Il y a hyperactivation de la nage liée à une entrée de Ca2+ dans le cytoplasme qui aboutit à la phosphorylation et à l’activation des dynéines flagellaires. Des récepteurs spermatiques sont démasqués. Tous ces phénomènes sont post-traductionnels car il n’y a plus de transcription, ni de traduction dans les spermatozoïdes matures.

***Voies de signalisation et flux ioniques impliqués dans la capacitation du spermatozoïde humain. Les spermatozoïdes sont exposés à une concentration plus élevée de HCO3au moment de l’éjaculation et pendant leur transit dans l’appareil reproducteur féminin. De plus, l’élimination du cholestérol de la membrane plasmique des spermatozoïdes vers les accepteurs présents dans l’utérus et les trompes de Fallope, tels que l’albumine, entraîne une modification biophysique de la membrane plasmique. Cela provoque une augmentation de la fluidité membranaire. Le transport initial de HCO3 à travers les cotransporteurs NBC active ADCY10 et cela produit à son tour une augmentation de la concentration d’AMPc, conduisant à l’activation de la PKA. La phosphorylation par PKA est essentielle pour l’activité CFTR, et avec d’autres cotransporteurs Cl/HCO3 (SLC A3/6/8), elle conduit à une augmentation soutenue de HCO3. D’autres sources possibles de HCO3 peuvent être liées à l’action des anhydrases carboniques. Parallèlement, au contact du HCO3, il y a une augmentation du pH intracellulaire des spermatozoïdes. Cette alcalinisation du cytoplasme est également favorisée par l’efflux de protons à travers les canaux Hv1. L’alcalinisation et certains stéroïdes présents dans l’appareil reproducteur féminin comme la progestérone activent les canaux CatSper et produisent une augmentation soutenue de [Ca2+] intracellulaire. Via une chaine d’enzymes, cela va provoquer une phosphorylation des moteurs moteurs dans le flagelle qui stimule la nage. Les niveaux de [Ca2+] intracellulaires sont également régulés par l’action d’échangeurs et de pompes comme le NCX et le PMCA. L’activation des voies AMPc/PKA conduit également à une hyperpolarisation de la membrane plasmique. Na+/K+ ATPase, Na+/K+ ATPase de pompe; SLO1 et 3, canaux K+ spécifiques du sperme 1 et 3 ; ENaC, canaux Na+ épithéliaux ; CFTR, canal de conductance transmembranaire de la mucoviscidose ; SLC26, porteur de soluté 26 ; Hv1, canaux H+ voltage-dépendants ; BSA, albumine de sérum bovin; CHO, cholestérol; CA, anhydrase carbonique; PYK2/FER, tyrosine kinase 2 riche en proline; ADCY10, adénylylcyclase soluble atypique 10; EPAC, protéine d’échange activée par l’AMPc ; CaM, calmoduline; CatSper, canal Ca2+ spécifique du sperme ; NCX, échangeur Na+/Ca2+; ATPase Ca2+ de la membrane plasmatique PMCA ; PG, progestérone; ABDH2, protéine 2 contenant le domaine hydrolase α/β ; 2-AG, 2-arachidonoylglycérol; AA, acide arachidonique; G, glycérol. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2018.00072/full

C’est au sein de l’oviducte que la nage flagellaire devient cruciale. Les spermatozoïdes ont besoin de mécanismes de navigation pour nager dans la bonne direction. Ces mécanismes de navigation reposent sur des signaux biochimiques et biophysiques externes (Tung et al., 2015). Les spermatozoïdes sont guidés par un gradient de température (thermocline de 2°C) le long de l’oviducte (de l’entrée à la région appelée ampoule où a lieu la fécondation). Les spermatozoïdes capacités sont très sensibles aux variations de température et ils sont capables de détecter un gradient de 0,014°C par millimètre ! Sur la membrane plasmique du spermatozoïde, un canal calcique activable par la progestérone appelé CatSper stimule la nage flagellaire. CatSper est un complexe de 9 protéines : 4 qui forment un canal et 5 protéines régulatrices. Sachant que les cellules de la corona radiata entourant l’ovocyte sécrètent de la progestérone, cela permet d’expliquer la chémoattraction des spermatozoïdes.

*Rôle de CatSper dans la motilité du flagelle des spermatozoïdes. La tête de spermatozoïdes capacités est fixée sur un substrat adhérent et on peut ainsi observer les mouvements de leur flagelle. Les spermatozoïdes sont soit hétérozygotes (A) ou homozygotes (B) pour une mutation perte-de-fonction affectant une sous-unité de CatSper. Source : https://elifesciences.org/articles/23082

Les cellules entourant l’ovocyte sécrètent également la protéine CRISP1 qui se lie aussi à CatSper (Ernesto et al., 2015). Il modulerait la nage des spermatozoïdes à proximité du l’ovocyte et des cellules environnantes pour la rendre plus efficace. Seuls 200 spermatozoïdes environ finiront par atteindre l’ovocyte. Par ailleurs, les spermatozoïdes peuvent survivre jusqu’à 6 jours dans les voies génitales femelles (Wilcox et al., 1995).

Contact et fusion entre les gamètes

La grande majorité des données classiques sur la fécondation des Mammifères a été obtenue in vitro. Or in vivo, des souris knock-out pour des acteurs jugés essentiels pour la fécondation in vitro se sont révélées être fertiles, ce qui a amené à corriger les modèles classiques.

Chez les Mammifères, la zone pellucide est une matrice glycoprotéique qui entoure les ovocytes et a une épaisseur moyenne de 17 µm. Elle est essentielle pour la fécondation (plus précisément pour la reconnaissance des gamètes et pour la prévention de la polyspermie), et pour la protection des embryons précoces avant l’implantation. La zone pellucide est composée essentiellement de 3 à 4 glycoprotéines appelées ZP1 à ZP4. Chaque protéine ZP est un polypeptide qui est glycosylé de manière hétérogène avec des oligosaccharides liés à l’asparagine (N-) et à la sérine/thréonine (O-) qui, dans certains cas, sont sialylés et sulfatés. Chez certains mammifères, tels que le chat, la vache, le chien et le porc, ZP1 n’est pas présent et sa fonction est complètement remplacée par ZP4. Chez la souris, ZP4 n’est pas présent puisqu’il est codé par un pseudogène qui n’est pas exprimé lors de l’ovogenèse (Goudet et al., 2008). ZP1 et ZP4 proviennent de la duplication récente d’un gène ancestral et cela est suivi des vicissitudes habituelles dans ce cas avec de possibles transformations en pseudogènes ou délétion par redondance fonctionnelle (Smith et al., 2005). ZP2 est assez apparenté à ZP1 et ZP4. Par contre, ZP3 est évolutivement assez éloigné des 3 autres (Goudet et al., 2008).

Chez la souris, le knock-out ciblé soit du gène codant ZP2 soit du gène codant ZP3 empêche le développement d’une zone pellucide, conduisant à la stérilité. Des cas de stérilité dans une famille ont été reliés à une mutation dans ZP1 qui aboutit à une protéine aberrante qui reste dans le cytoplasme. Bien que normale, la protéine ZP3 qui s’associe à ZP1 reste également dans le cytoplasme et n’est pas secrétée (Huang et al., 2014), mettant en évidence la dépendance de ZP3 vis-à-vis de ZP1 pour sa localisation finale.

ZP2 et ZP3 semblent être les glycoprotéines sur lesquelles s’attache le spermatozoïde lors de son arrivée dans la zone pellucide. La comparaison des séquences de ZP3 de différentes espèces de mammifères révèle un degré élevé de divergence dans son domaine d’interaction avec le spermatozoïde par rapport à d’autres régions de la protéine. Cette divergence est attribuée à une sélection darwinienne positive et assure sans doute une importante spécificité d’espèce lors de la fécondation (Williams et al., 2005). Lorsqu’on essaie de féconder des ovocytes de souris avec des spermatozoïdes humains, cela échoue mais lorsque ces ovocytes de souris expriment ZP2 humain alors cela réussit, montrant aussi l’importance du ZP2 dans les reconnaissances spécifiques des espèces (Baibakov et al., 2012).

La réaction acrosomiale est une exocytose dépendant du Ca2+ qui permet au spermatozoïde d’excréter le contenu de son acrosome. Dans les modèles classiques, elle était dépendante de l’interaction avec la zone pellucide. Il semble cependant que la réaction acrosomiale puisse avoir lieu avant, indépendamment de la zone pellucide. Cette réaction libère des enzymes notamment la hyaluronidase qui permet au spermatozoïde de se frayer un chemin à travers la corona radiata et la zone pellucide. La réaction acrosomiale permet aussi de placer à la surface du spermatozoïde la protéine IZUMO qui sera importante pour la fusion avec l’ovocyte.

*Observation d’une réaction acrosomiale en temps réel. Un spermatozoïde est immobilisé sur de la poly-L-lysine et incubé avec de l’agglutinine du pois (Pisa sativum) couplé au fluorophore FITC (PSA-FITC). Cette molécule se fixe sur des protéines exposées à la surface du spermatozoïde exclusivement après la réaction acrosomiale. La réaction acrosomiale est activée à t=Os par une molécule qui active Rab3A (voir plus loin dans le texte). Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)44442-4/fulltext

Des réactions acrosomiales trop précoces peuvent aboutir à de l’infertilité (Tesarik et Mendoza, 1995). Son déclenchement est donc étroitement régulé. Un pic de concentration d’AMPcyclique active la PKA (protéine kinase A) qui déclenche une cascade de signalisation aboutissant à l’activation de petites GTPases Rap1 et Rab3A qui remodèlent le cytosquelette et le trafic membranaire ce qui aboutit à la réaction acrosomiale (Pelletan et al., 2015).

La fusion des membranes plasmiques des 2 gamètes est initiée par l’interaction de IZUMO sur la membrane plasmique du spermatozoïde et de JUNO sur celle de l’ovocyte (Bianchi et al., 2014; Aydin et al., 2016). Les souris mâles déficientes en Izumo (mais pas les souris femelles) sont stériles car le sperme dépourvu d’Izumo ne peut pas fusionner avec les ovules. La zone pellucide des ovocytes Juno−/− est pénétrée in vivo par des spermatozoïdes de type sauvage, mais ceux-ci ne fusionnent pas avec l’ovocyte muté. Si on revient à la situation normale, après la fusion du spermatozoïde avec l’ovocyte, Juno est éliminé de la membrane plasmique ce qui constitue un mécanisme de blocage de la polyspermie (Bianchi et al., 2014).

*Juno devient rapidement indétectable de la surface cellulaire après la fécondation. Juno (fluorescence vert) est exprimé sur les ovocytes ovulés en métaphase II, mais est à peine détectable à la télophase II qui résulte du déblocage de la méiose par la fécondation et Juno devient indétectable sur les zygotes au stade pronucléaire. La flèche et l’astérisque indiquent les sites d’extrusion du premier et du deuxième globule polaire. Les chromosomes ne sont pas dans le plan focal. Source : https://www.nature.com/articles/nature13203

Depuis récemment, on sait que des mitochondries de la pièce intermédiaire du spermatozoïde passent dans le cytoplasme de l’ovocyte mais elles sont éliminées par autophagie. La transmission uniquement maternelle des mitochondries est ainsi préservée.

Conséquences de la fécondation

Chez les amphibiens, l’arrivée du spermatozoïde se fait toujours par l’hémisphère animal. Elle entraîne un blocage de la polyspermie rapide sous la forme d’une dépolarisation membranaire. Une augmentation de la concentration du Ca2+ cytoplasmique provoque l’exocytose des granules corticaux.

*Observation d’une vague d’augmentation de la concentration calcique après la fécondation chez le xénope. L’ovocyte avait été injecté au préalable avec un fluorophore dont la fluorescence dépend de la concentration en Ca2+.

Les mucopolysaccharides des granules corticaux provoquent un appel d’eau dont l’afflux génère un espace entre la membrane plasmique et l’enveloppe vitelline, l’espace périvitellin : le zygote n’est plus relié à la gangue et à cause de la densité importante en vitellus du côté végétatif, il se tourne le pôle végétatif vers le bas et le pôle animal vers le haut (alors qu’auparavant son orientation était aléatoire). C’est la rotation d’équilibration qui a lieu habituellement 30 min après la fécondation. Lors de fécondations in vitro dans les laboratoires, c’est un bon indicateur que la fécondation a bien marché.

Les granules corticaux contiennent aussi des enzymes qui modifient la composition de la membrane vitelline et la transforme en membrane de fécondation (ou chorion). Le blocage de la polyspermie est donc d’abord ionique (dépolarisation), physique (espace périvitellin) et biochimique (composition de la membrane de fécondation).

Il existe une deuxième rotation qui a lieu 1h30 environ après la fécondation : la rotation de la couche superficielle du cytoplasme d’un angle de 30° environ vers son point d’entrée. C’est la rotation corticale. Les granules de mélanine sont entraînés par le cytoplasme mais certains restent en place formant un croissant gris. Ce croissant gris marque la future région dorsale de l’embryon. Si on irradie la région végétative de l’ovocyte avec des UV, on perturbe la réaction corticale et on obtient des embryons tronqués, sans région dorsale et sans tête. Ceci est expliqué par le fait que lors de la rotation corticale, certaines molécules (protéines et ARNm) importants pour la formation de la région dorsale sont entraînées du pôle végétatif vers le côté du croissant gris. Un deuxième axe (dorso-ventral) est ainsi formé, perpendiculaire à l’axe pôle animal-pôle végétatif qui avait été mis en place pendant l’ovogenèse. L’axe dorso-ventral n’est pas clairement séparé de l’axe antéro-postérieur de l’animal à ces stades précoces.

*Rotation corticale à la suite de la fécondation chez les Amphibiens. La calotte pigmentaire de l’hémisphère animal bascule vers le point d’entrée du spermatozoïde laissant à l’opposé de celui-ci des traînées de pigment cortical qui prennent la forme d’un croissant d’où le terme de croissant gris (CG). Après cet événement, la future région dorsale de l’embryon apparaîtra du côté le plus clair du zygote. D: face dorsale, PA: Pôle Animal, PV: Pôle Végetatif, V: face ventrale. Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/xenope1/xenope2.htm

La rotation corticale dépend du réseau de microtubules. Après la fécondation, sous le contrôle du centriole amené par le spermatozoïde, des faisceaux de microtubules s’assemblent sous le cytoplasme cortical. Dans l’hémisphère végétatif, ces faisceaux sont parallèles.

*Faisceaux parallèles de microtubules observés par immuofluorescence anti-tubuline. Vue du pôle végétatif dans un zygote de xénope, 80 minutes après la fécondation. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/136/18/3057/65351/Vegetally-localized-Xenopus-trim36-regulates

L’irradiation aux UV précédemment citée créé des liaisons covalentes entre le GTP et la tubuline et perturbe cette organisation. Un traitement à la colchicine ou au nocodazole perturbe aussi la formation des microtubules et inhibe la rotation corticale. On peut suivre les déplacements liés à la rotation corticale grâce à des microbilles fluorescentes.

Lors de la fécondation chez les Mammifères, l’entrée du spermatozoïde provoque une dépolarisation membranaire et une succession de pics de concentration en Ca2+ cytoplasmique (qui activent la protéine kinase dépendante de la calmoduline CaMKII (Knott et al., 2006)). Ces hausses de concentration calcique dépendent de PLC-ζ, une phospholipase C apportée par le spermatozoïde qui clive PI(4,5)P2 et permet de produire IP3 (inositol-triphosphate) qui active le sortie du Ca2+ du réticulum endoplasmique vers le cytosol. Une très forte concentration Ca2+ cause la fermeture des canaux Ca2+ du réticulum endoplasmique et un repompage se fait d’où la forme en pic de ce signal. Plusieurs pics se succèdent. Ces pics calciques provoquent l’exocytose des granules corticaux et le déblocage de la méiose qui se termine avec l’expulsion du deuxième globule polaire.

*La fécondation provoque l’exocytose des granules corticaux via la libération d’ions Ca2+ du réticulum endoplasmique (RE). Des flux calciques provenant de l’extérieur peuvent aussi intervenir dans un second temps. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.704867/full

Seuls 4 pics calciques sont nécessaires pour déclencher l’exocytose des granules corticaux mais il en faut au moins 8 pour faire redémarrer la méiose (Ozil et al., 2005). Les enzymes dans les granules corticaux clivent les protéines ZP de la zone pellucide. Par exemple, la protéase ovastacine clive ZP2 qui perd sa capacité à interagir avec les spermatozoïdes. On observe aussi des mouvements cytoplasmiques rythmés qui dépendent de l’interaction actine-myosine et des pics de concentrations en Ca2+. Le blocage de ces mouvements cytoplasmiques aboutit à des développements anormaux mais leur fonction précise n’est pas encore claire (Ajduk et al., 2011).

***Des flux cytoplasmiques rythmés sont corrélés à des pics de Ca2+ cytoplasmique juste après la fécondation dans le zygote de la souris. Les ovocytes sont préalablement à la fécondation chargés avec le FuraRed qui est un fluorochrome dont l’intensité dépend de la concentration en Ca2+. Source : https://www.nature.com/articles/ncomms1424

Le matériel génétique paternel et maternel se trouvent dans des noyaux séparés appelés pronucléi (un pronucléus). Chacun fait réplication à part et ce n’est que lors de la métaphase de la première mitose que les chromosomes se retrouvent côte à côte. Ainsi, les premiers noyaux vraiment diploïdes sont ceux de l’embryon au stade 2 cellules.

Les particularités de la fécondation chez la drosophile. La drosophile présente quelques différences notables avec les fécondations décrites ici. L’activation de l’ovocyte a lieu lors de l’ovulation, avant même que l’arrivée des spermatozoïdes. Des canaux calciques s’ouvrent et les concentration en Ca2+ augmentent dans le cytoplasme, indépendamment du spermatozoïde. Celui-ci ne peut féconder qu’une région bien précise de l’ovule, celle qui se trouve sous le micropyle qui est un tunnel creusé dans la paroi de l’œuf (chorion). Elle correspond à la future région dorsale antérieure. Le micropyle ne peut être traversé que par un spermatozoïde à la fois, ce qui limite les risques de polyspermie. Il n’y a pas d’exocytose de granules corticaux.

La procréation médicalement assistée (PMA)

La PMA apporte une réponse à la stérilité ou à l’infertilité et représentait 3,4% des naissances en France en 2018 (contre 2,6% en 2009).

Selon le type d’infertilité il y a plusieurs options de traitement : thérapie médicamenteuse (induction de l’ovulation), fécondation in vitro (FIV) et transfert embryonnaire (FIVETE), insémination artificielle, injection intracytoplasmique de spermatozoïde (ICSI).

*Différences entre PMA et développement normal. Au cours de la PMA, la maturation de multiples ovocytes est réalisée grâce à de fortes stimulations hormonales et de multiples ovocytes sont prélevés dans l’ovaire alors que naturellement seul un ovocyte est ovulé. Lors de la PMA, la fécondation et le début du développement embryonnaire se font dans un milieu artificiel (avec un pH, un taux d’oxygénation, une osmolalité… contrôlés) et les embryons issus de la PMA sont transférés dans l’utérus au stade blastocyste avant le stade normal de l’implantation tandis que la fécondation et l’embryogenèse « naturelles » se déroulent dans l’organisme maternel avec des échanges de signaux. Des modifications épigénétiques peuvent résulter des modifications qu’apporte la PMA par rapport à la procréation naturelle et ont pu être liées à une plus grande susceptibilité à certaines pathologies. Source : https://www.mdpi.com/2077-0383/11/8/2151/htm

La première naissance d’un enfant issu du FIV a eu lieu en 1978 (Louise Brown en Angleterre). En France, cela est arrivé avec Amandine en 1982. La procédure est la suivante : une stimulation hormonale ovarienne et un suivi du développement des follicules par échographie. Les ovocytes sont prélevés quelques heures avant l’ovulation puis mis en présence des spermatozoïdes préparés. Les embryons obtenus sont cultivés in vitro pendant 2 à 6 jours afin d’évaluer leur bon développement par leur morphologie. Un ou deux embryons sont implantés, les autres peuvent être congelés.

Pour l’ICSI, on charge dans une micropipette un spermatozoïde dont on casse le flagelle et on l’injecte dans le cytoplasme ovocytaire. La première ICSI a été réalisée en Belgique en 1992. Les indications de cette technique sont de graves défauts de mobilité des spermatozoïdes, des anomalies de la zone pellucide, des anomalies des capacités fusiogènes des membranes plasmiques des gamètes et des anomalies de l’exocytose des granules corticaux (pouvant mener à la polyspermie). La technique est devenue très utilisée, jusqu’à 2/3 des procédures de PMA dans certains pays (Dyer et al., 2016).

*Réalisation d’une ICSI. Source : https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Icsi.JPG

> Après la fécondation, a lieu le clivage.

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