Les étapes du développement embryonnaire d’Arabidopsis thaliana et leur contrôle

Introduction

Le développement embryonnaire d’Arabidopsis, a lieu dans la graine qui assure la dispersion de l’espèce et la survie et la protection de l’embryon.

La double fécondation (caractéristique des Angiospermes) aboutit à deux zygotes : le premier (diploïde, issu de la fusion d’un gamète mâle et de l’oosphère) donne l’embryon et le deuxième (triploïde, issu de la fusion d’un gamète mâle et de deux noyaux secondaires du gamétophyte femelle (= sac embryonnaire)) forme un tissu de réserve : l’albumen. Les réserves protéiques, lipidiques et glucidiques y sont produites et stockées lors de la phase de maturation de la graine qui suit les principales étapes du développement embryonnaire. La teneur en eau de la graine diminue ensuite fortement. Cette dessiccation est un des facteurs de l’entrée en dormance de la graine et permet sa conservation jusqu’à sa germination.

Le développement embryonnaire d’Arabidopsis thaliana peut aussi s’observer par embryogenèse somatique, à partir de cellules non issues directement de la fécondation et qui se dédifférencient. Bien qu’il existe des différences entre l’embryogenèse somatique et l’embryogenèse « classique », on observe les mêmes stades et de grandes similarités de mécanismes (Joshi et al., 2022).

**Embryogenèse somatique. Un explant est traité par des hormones végétales (PGR pour Plant Growth Regulators) telles que l’auxine ou les cytokinines et mis en état de stress (mécanique, hydrique ou nutritionnel). Des changements épigénétiques sont induits et les cellules se dédifférencient (changent notamment de morphologie et le ratio noyau/cytoplasme augmente). Dans l’embryogenèse somatique indirecte, on laisse un cal de cellules en prolifération se former tandis que dans l’embryogenèse somatique directe, l’embryogenèse commence tout de suite. Les embryons somatiques passent par les mêmes stades (à gauche) que les embryons « normaux ». Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.861556/full#B117

Quelque soit les modalités d’observation de l’embryogenèse, l’orientation des divisions cellulaires a une importance cruciale car, du fait de la présence de la paroi, les cellules d’un organisme végétal ne peuvent pas se déplacer. Elle est aussi importante tout comme la croissance cellulaire pour la mise en place des deux axes principaux : apico-basal et l’axe radiaire.

Présentation générale des étapes

*Etapes clés du développement de l’embryon d’Arabidopsis thaliana. AC = cellule apicale ; BC = cellule basale ; EP = embryon proprement dit ; S = suspenseur ; DS = suspenseur en dégénérescence. Établissement du protoderme (vert), de l’hypophyse (rouge), du méristème provasculaire (rose). La cellule en forme de lentille qui est le précurseur du centre de repos (QC) est en bleu foncé. La cellule basale de l’hypophyse qui fera partie de la racine est en jaune. Le méristème apical de la racine est en violet et le méristème apical caulinaire (MAC) est en vert foncé au stade torpedo. Aucune échelle commune n’a été utilisée dans les dessins. Certains noyaux ne sont pas représentés. Source : https://portlandpress.com/biochemj/article-pdf/477/19/3743/894729/bcj-2019-0161c.pdf

La première division asymétrique et ses conséquences

Le zygote s’allonge jusqu’à atteindre trois fois sa longueur initiale puis réalise une division asymétrique qui donne naissance à une petite cellule apicale et à une grande cellule basale. Ensuite, la cellule apicale donne naissance au proembryon et la cellule basale donne naissance essentiellement à une structure extraembryonnaire : le suspenseur qui relie l’embryon en développement au tissu maternel et qui facilite l’apport de nutriments à l’embryon. Le suspenseur finit par être formé de 7 cellules chez Arabidopsis (mais il peut être composé de jusqu’à 200 cellules chez certaines Fabacées). Une fois leurs tâches accomplies, les cellules du suspenseur meurent par apoptose lors de la phase de maturation de la graine. La cellule basale donne néanmoins aussi naissance à quelques cellules de l’embryon : l’hypophyse.

Cette croissance du zygote et cette première division asymétrique est sous le contrôle de la MAPKK (MAP kinase kinase) YODA. Un gain-de-fonction de YODA aboutit à une élongation excessive du zygote et à un suspenseur qui est trop grand (Lukowitz et al., 2004).

La première division asymétrique du zygote jette les bases de la structuration apico-basale de l’embryon. Les facteurs de transcription de la famille WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX (WOX) jouent un rôle clé lors de cette étape. WOX8/STIMPY est exprimé dans le zygote, où un autre facteur de transcription, WRKY2, régule son expression. Cette interaction WRKY2-WOX8 est nécessaire pour la distribution polaire des organites cellulaires dans le zygote, créant la polarité zygotique nécessaire pour rendre la première division asymétrique (Ueda et al. 2011). WOX2, co-exprimé avec WOX8 dans le zygote, s’exprime dans la cellule apicale après la division zygotique asymétrique. Au cours de la suite de l’embryogenèse, WOX2 est nécessaire pour mettre en place la région la plus apicale et notamment le développement du méristème apical caulinaire (MAC). En revanche, WOX8 est exprimé dans la cellule basale avec son homologue le plus proche WOX9/STIMPY-LIKE après la division zygotique, régulant la lignée cellulaire basale. Ils régulent également l’embryon proprement dit en activant l’expression de WOX2 dans la région apicale (Breuninger et al. 2008).

*Contrôle de la première division asymétrique et du destin de la cellule apicale et de la cellule basale. Dans le zygote, WRKY2 active l’expression de WOX8 pour favoriser la polarisation de la position du noyau (marron) et des vacuoles (jaune clair) et la division asymétrique du zygote. Dans l’embryon asymétrique à 2 cellules qui en résulte, WRKY2-WOX8/9 régule de manière non autonome le développement de l’embryon proprement dit en activant l’expression de WOX2 (vert) dans la région apicale. Source : https://link.springer.com/article/10.1007/s00425-022-03870-x

La cellule apicale subit trois mitoses et forme une structure sphérique appelée embryon octant. Le développement de la moitié supérieure de cet embryon produit la partie aérienne de la plantule tandis que la partie inférieure se différencie en hypocotyle et radicule.

L’auxine est produite par l’embryon dans sa région apicale mais provient également du suspenseur. Avec l’auxine, ce n’est pas tant la zone de production qui est importante mais son transport et son accumulation. L’auxine migre via des transporteurs spécifiques (transporteurs PIN) jusqu’à la partie supérieure du suspenseur appelé hypophyse, dans laquelle elle s’accumule lors du stade globulaire. Cette migration contribue à la formation de la polarité apico-basale qui est responsable de la mise en place du méristème apical caulinaire. La mutation dans les transporteurs de l’auxine (Tanaka et al., 2006) conduit
à la formation d’un embryon anormal. L’inactivation du récepteur ABP1 (Auxin Binding Protein) provoque un arrêt du développement de l’embryon après le stade globulaire car les cellules ne peuvent pas s’allonger (Chen et al., 2001). La mutation perte-de-fonction de MONOPTEROS aboutit à la disparition d’une grande partie de la région basale. MONOPTEROS code le facteur de transcription ARF5 dont l’activité dépend de l’auxine (Hardtke et Berleth, 1998). Il se fixe sur des séquences spécifiques devant les gènes dont l’expression est activée par l’auxine, les AuxRE (pour Auxin Response Element). MONOPTEROS/ARF5 est aussi impliqué dans la formation des premiers vaisseaux (Weijers et al., 2006). L’auxine joue également un rôle dans le positionnement du plan de clivage lors des divisions cellulaires. Elle le fait en contrôlant l’expression de IQD6, une protéine associée aux microtubules et qui contrôle leur dynamique (Vaddepalli et al., 2021).

L’embryon au stade coeur

Au stade coeur, on considère que la plupart des futurs tissus de la plante sont spécifiés. La symétrie bilatérale se matérialise par le développement des 2 cotylédons. Le méristème apical caulinaire est mis en place entre les 2 cotylédons. La partie médiane de l’embryon s’appelle l’hypocotyle et la partie basale donnae naissance au méristème racinaire.

En parallèle, l’albumen se développe : il est tout d’abord syncitial
au début de l’embryogenèse puis cellularisé à partir du développement des cotylédons au stade coeur. Il est totalement cellularisé au stade torpille et il progressivement absorbé par les cotylédons lors de leur croissance.

Au stade coeur, l’intense prolifération dans l’embryon qui avait lieu jusque là diminue, sauf dans les méristèmes. Les croissances cellulaires deviennent plus fréquentes. Les protéines ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3 (ABI3), FUSCA 3 (FUS3) et LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2), nommées collectivement AFL, ainsi que LEAFY COTYLEDON 1 (LEC1) sont impliquées dans cette transition. La transcription des gènes codant ces protéines est réprimée par les facteurs E2F qui sont impliqués dans la progression G1/S du cycle cellulaire (Leviczky et al., 2019).

C’est au stade coeur que le gène FACKEL commence à être exprimé dans des régions précises de l’embryon. Chez les mutants perte-de-fonction, l’élongation des cellules se fait mal ainsi que l’orientation des divisions aboutissant à un hypocotyle absent, ce qui amène les cotylédons à être attachés directement à la radicule.

*Hybridation in situ avec une sonde reconnaissant l’ARNm de FACKEL dans un embryon de stade coeur d’Arabidopsis. La révélation apporte une couleur rouge/brun. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC316688/

Le gène FACKEL code une stérol-C14-réductase (Schrick et al., 2000).

Les futures cellules de l’épiderme sont alors déterminées : elles donneront plus tard soit des cellules épidermiques « classiques », soit des cellules de garde des stomates, soit des trichomes. Elles se divisent de manière péricline. Les cellules de l’épiderme sont déterminées avec notamment l’activation de l’expression d’ARABIDOPSIS THALIANA MERISTEM L1 LAYER (ATML1) (Iida et al., 2019).

*Le gène codant ATML1 est spécifiquement exprimé dans les futures cellules de l’épiderme dans l’embryon au stade coeur. On observe en microscopie à fluorescence un embryon au stade coeur qui est transgénique avec la séquence codante (répétée 3 fois) de la GFP sous le contrôle du promoteur de ATML1. Barre d’échelle = 10 µm. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/4/dev169300/48989/ATML1-activity-is-restricted-to-the-outermost

L’expression ectopique d’ATML1 dans des cellules plus internes suffit à donner à ces cellules des caractères épidermiques montrant le rôle instructeur de ce gène pour le destin des cellules (Takada et al., 2013).

Mise en place du MAC et des cotylédons

C’est au stade globulaire que la partie apicale de l’embryon se divise en 3 : la région qui va donner le MAC, la région qui va donner les cotylédons et la région entre les deux. Le développement initial de cette région apicale dépend du produit du gène Gurke. Les mutants perte-de-fonction ont un défaut important des régions apicales, avec la présence de cotylédons rudimentaires pour les allèles les moins sévères.

*La fonction de Gurke est nécessaire pour le développement de la région apicale d’Arabidopsis. A = plantule sauvage; B = plantule du même âge avec une mutation perte-de-fonction complète de Gurke; C = plantule du même âge avec une mutation perte-de-fonction partielle de Gurke. Source : https://academic.oup.com/pcp/article/45/9/1122/1857702

Gurken correspond au gène ACC1 qui code une acétyl-coA carboxylase qui catalyse la synthèse de malonyl-coA à partir d’acétyl-coA et de bicarbonate (Baud et al., 2004). On ne comprend pas encore bien par quel relais cette voie métabolique aboutit à mettre en place toute la structure apicale de l’embryon.

**Patrons d’expression des gènes à l’origine du développement du méristème apical caulinaire (MAC). (A) Embryon globulaire. Le gène AtML1 spécifique de l’épiderme est exprimé à la fois dans la région centrale et dans la région apicale (jaune ; non représenté en B et C). La flèche blanche indique un signal de la région centrale dans le positionnement de l’ébauche du MAC. (B) Embryon au stade de transition affichant essentiellement le même schéma d’expression que l’embryon globulaire. (C) Extrémité supérieure de l’embryon au stade coeur. Les domaines d’expression des gènes de structuration radiale, SCR et SHR, et de ZLL/PNH ne sont pas représentés. Dans l’ébauche du MAC, les domaines d’expression de CLV3 et CLV1 se chevauchent. Notez les domaines d’expression génique adaxial (REV) et abaxial (FIL, YAB3) dans les ébauches de cotylédons. REV est également exprimé dans l’ébauche vasculaire. Source : https://www.embopress.org/doi/full/10.1093/emboj/20.14.3609

Les mutations de perte de fonction dans le gène SHOOTMERISTEMLESS (STM), qui code un facteur de transcription à homéodomaine de la classe KNOTTED entraînent également un défaut de maintien du MAC. Les cellules de l’apex des embryons mutants stm se différencient au lieu de rester à l’état de cellule souche (Endrizzi et al., 1996). De plus, les mutants stm présentent une fusion des pétioles des cotylédons. La répression de la différenciation par STM dans le MAC semble se produire principalement via la répression du gène ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) puisque la perte-de-fonction de AS1 dans un fond mutant stm sauve la formation de MAC (Byrne et al., 2000). L’ARNm de STM est exprimé dans l’ébauche du MAC à partir du stade embryonnaire globulaire, et l’expression post-embryonnaire se trouve dans tout le MAC, mais est exclue des ébauches d’organes naissants (Long et al., 1996).

Les facteurs de transcription homéodomaine-leucine zipper de classe III (HD-ZIP III) favorisent la mise en place du MAC. Leur activité est régulée négativement par les microARNs miR165 et miR166 en complexe avec la protéine AGO1 et qui clivent les ARNm HD-ZIP III (Byrne, 2006). AGO1 lie également miR168 pour cliver son propre ARNm, garantissant des niveaux d’expression corrects d’AGO1. La perturbation de cette régulation par rétroaction négative entraîne une augmentation des niveaux d’AGO1 qui provoque des défauts phénotypiques pléiotropes, notamment la disparition du MAC (Vaucheret et al., 2004). Au cours du développement, la protéine ZLL empêche l’action de miR165 et miR166 dans une large zone centrale de l’embryon, permettant au MAC de se mettre en place par l’action des facteurs HD-ZIPIII.

**Fonction de AGO1, ZLL et miR165/166 au cours de l’embryogenèse. La protéine ZLL séquestre miR165/166 et les empêche d’interagir avec AGO1, permettant ainsi l’accumulation d’ARNm HD-ZIPIII dans la région du MAC et la mise en place puis le maintien des cellules souches (exprimant CLV3). Dans l’embryon mutant perte-de-fonction zll (à droite), des niveaux plus élevés de miR165/166 peuvent se lier à AGO1, entraînant une réduction des niveaux de transcription HD-ZIPIII et la disparition du méristème par extinction de l’expression de CLV3. Les domaines d’expression génique sont indiqués. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2011.00093/full

Par rapport aux feuilles ordinaires, les cotylédons présentent de grandes différences dans la morphologie et les patrons d’expression des gènes. Lorsque LEC2 (Leafy Cotyledon-2) est muté, les cotylédons subissent certains changements, notamment prennent une forme arrondie et développent des et protubérances anormales à leur surface. Les cotylédons mutants produisent des trichomes caractéristiques des feuilles, indiquant que LEC2 est important pour le maintien des caractéristiques des cotylédons au début de l’embryogenèse (Meinke, 1992).

Les cotylédons de certaines Angiospermes (comme les haricots) peuvent accumuler de grandes quantités de réserve.

Le développement des plastes

Au cours du développement de l’embryon, les proplastes qui sont toujours issus du gamétophyte femelle (hérédité cytoplasmique maternelle) se différencient en chloroplastes à partir du stade globulaire, puis, après cette phase transitoire, ils se différencient en plastes de stockage, les eoplastes ou élaïoplastes (Allorent et al., 2013 ; Liebers et al., 2017) . A la germination, ces plastes redeviennent des chloroplastes sauf à l’obscurité où ils deviennent des étioplastes dans le cadre d’une morphogenèse particulière appellée skotomorphogenèse (caractérisée par des cotylédons repliés, un crochet apical, des tiges allongées, des racines courtes et un manque de chlorophylle et d’anthocyanes). De nombreux gènes plastidiaux sont essentiels au développement précoce des plantes et les mutations entraînent souvent la létalité des embryons (Ajjawi et al., 2010 ; Bryant et al., 2011).

*Transitions entre les différents types de plastes au cours du cycle de vie de la plante. Des étapes importantes dans le développement des tissus d’un angiosperme depuis la fécondation jusqu’au développement des fleurs sont représentées en utilisant le cycle de vie d’Arabidopsis thaliana. La partie interne (fond gris) indique les principaux types de plastes résidant dans les tissus du stade de développement correspondant. Les flèches indiquent le type et la direction de transition entre ces types de plastes. L’encart représentant une coupe transversale à travers un méristème apical caulinaire avec ses différents stades de développement du chloroplaste a été adapté de Charuvi et al., 2012. L1 – L3 représentent différentes couches cellulaires du méristème apical caulinaire contenant des chloroplastes avec différents degrés de développement de la membrane thylakoïde. Les changements dans l’appareil ou l’activité transcriptionnelle des plastides qui se produisent pendant ces transitions sont indiqués par les symboles NEP (pour Nuclear Encoded RNA Polymerase) et PEP (pour Plastid Encoded RNA Polymerase). La taille des lettres représente les activités relatives des deux types d’ARN polymérases (nucléaires ou plastidiques) dans le type de plaste respectif. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2017.00023/full

La vie de la graine

L’embryon se développe dans un contexte particulier : celui de la graine. L’embryon cotoie un tissu de réserve (l’albumen), le tout enveloppé dans des téguments protecteurs (issus du tégument de l’ovule). Le micropyle correspond à une cicatrice due au détachement de la graine à ce qui la retenait à l’ovaire (le funiculus).

*La graine d’Arabidopsis thaliana en dormance. L’albumen micropylaire correspond à une région particulière qui sécrétera des enzymes lytiques du tégument de la graine lors de la germination. Source : http://www.seedbiology.de/html2/pcp06-fig2.html

Durant la première phase de son développement, la graine accumule des réserves. Puis il y a déshydratation (avec une perte de plus de 90% de l’eau). Le métabolisme diminue drastiquement permettant une survie longue de l’embryon dans des conditions défavorables. Le tégument de la graine se durcit et devient une véritable enveloppe protectrice. La graine entre en dormance.

Le réveil de la graine et la continuation du développement de la plantule s’appelle la germination. Elle est contrôlée par l’humidité, la température et la photopériode.

La première structure à émerger de la graine lors de la germination est la racine primaire.