par Patrick PLA, Université Paris Saclay

SOMMAIRE : La culture cellulaire ; Le western-blot ; L’immunoprécipitation ; Le double-hybride ; Immunohistochimie/fluorescence ; Microscopie photonique ; Optogénétique ; Rapporteurs fluorescents de la concentration en Ca²⁺ ; La cytométrie de flux ; Microscopie électronique ; Etude de la migration cellulaire ; Etude de la prolifération du cycle cellulaire.

La culture cellulaire

La culture cellulaire in vitro concerne :

• des cultures primaires : c’est-à-dire des cellules prélevées sur un être vivant et que l’on met en culture in vitro mais qui ne peuvent pas être maintenues sur une longue durée de temps avec une prolifération élevée (entre autre, parce qu’elles atteignent la limite de Hayflick où elles entrent en sénescence, notamment à cause du raccourcissement des télomères à chaque réplication).
• des lignées cellulaires : c’est-à-dire des cellules prélevées sur un être vivant il y a longtemps et qui maintiennent des capacités de prolifération théoriquement illimitées (parce qu’elles sont cancéreuses, ou parce qu’elles ont des propriétés de cellules souches ou parce qu’elles ont été « immortalisées » en leur faisant exprimer un oncogène).

Des stocks de lignées cellulaires peuvent être conservées « indéfiniment » dans de l’azote liquide (cryoconservation à -196°C).

La culture cellulaire présente de nombreux avantages mais aussi des inconvénients. Les cellules sont dans un environnement contrôlé (température, nutriments disponibles, éventuellement matrice extracellulaire…) mais cet environnement est parfois éloigné des conditions physiologiques. Dans des cultures classiques en 2D chaque cellule est facilement visible, mais les propriétés des organisations 3D dans les tissus peuvent être perdues. Les capacités importantes de prolifération, notamment des lignées cellulaires utilisées permettent d’obtenir beaucoup de matériel pour faire des études de biochimie et facilitent les analyses statistiques mais une fois de plus les cellules ne sont pas dans leur cadre naturel et des cellules très proliférantes ne correspondent qu’à un profil particulier de cellules.

La culture cellulaire permet de diminuer le recours à l’expérimentation animale mais ne peut pas la remplacer complètement.

Les cellules sont cultivées dans un milieu nutritif contenant des nutriments et des vitamines et souvent additionné de sérum (sérum de veau foetal typiquement) dans lequel se trouvent des facteurs de croissance nécessaire à la prolifération. Pour les cellules qui prolifèrent, on suit le niveau de confluence, c’est-à-dire le pourcentage de la surface couvert par les cellules.

Des nouvelles technologies permettent un suivi en continu de l’adhérence, de la prolifération et de la migration des cellules lors de la culture.

Fractionnement cellulaire par centrifugation différentielle

Il s’agit d’une technique pour purifier des fractions particulières du contenu des cellules (noyau, mitochondries, ribosomes…). Elle est basée sur une série de centrifugation à des vitesses de plus en plus élevées qui permettent de précipiter des composants de plus en plus petits.

Western-blot

Il s’agit d’une méthode de séparation des protéines selon leur taille dans un gel de polyacrylamide puis de transfert vers une membrane où les protéines sont identifiées grâce à des anticorps.

Les anticorps utilisés (pour le western-blot ou d’autres techniques utilisant des anticorps) peuvent être de deux types :

• Des anticorps polyclonaux (en fait un mélange d’anticorps différents) qui sont produits par un animal (lapin, souris, chèvre…) après injection de l’antigène que l’on souhaite reconnaître.
• Des anticorps monoclonaux (tous identiques) contre un antigène donné produits dans des hybridomes, c’est-à-dire des lymphocytes B rendus « immortels » après fusion avec des cellules cancéreuses de myélome.

Présentation de la technique de western-blot en vidéo :

Un exemple de protocole d’extraction de protéines et de western-Blot en détail :

Les cellules ont été lysées dans du tampon RIPA (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,25 % Na-désoxycholate, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]) contenant 1 comprimé
d’inhibiteur de protéase et 1 comprimé d’inhibiteur de phosphatase par 10 ml. La concentration totale de protéines dans les lysats a été déterminée à l’aide d’un kit Pierce BCA Protein Assay. L’absorbance a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaque. Un gel de polyacrylamide à 8 % contenant du SDS surmonté d’un gel de stacking (pour concentrer les protéines) a été préparé. Ensuite, 15 µL de mélange d’échantillons, contenant 9 µg de protéines totales et 5 µL de tampon d’échantillon (5,7 ml d’eau, 1,6 ml de glycérol, 1,1 ml de SDS à 10 %, 1,3 ml de Tris 0,5 M (pH 6,8), 25 mg de dithiotréitol (DTT, casse les ponts disulfures des protéines), 300 µL de bleu de bromophénol) ont été chauffés à 90 °C pendant 5 min (pour dénaturer les protéines), refroidis sur de la glace et chargé sur le gel. Le gel a été incubé dans du tampon d’électrophorèse (Tris Base 25 mM, glycine 190 mM, 0,1 % SDS) à 70 V jusqu’à ce que les échantillons atteignent le gel de séparation, puis à 150 V jusqu’à ce que les échantillons atteignent le bas du gel. Ensuite, les protéines ont été transférées sur une membrane en polyfluorure de vinylidène (PVDF) pendant 1 h à 80 V sur glace dans un tampon de transfert froid (Tris base 25 mM, glycine 190 mM, éthanol 20%). La membrane a été rincée à l’eau et lavée 2x dans une solution saline tamponnée au Tris et du Tween-20 (TBS-T) (20 mM de Tris/HCl, 137 mM de NaCl, 0,1 % de Tween-20). La membrane a été incubée pendant 1 h à température ambiante dans un tampon de blocage (5% BSA dans du TBS-T, sature les sites non spécifiques sur lesquels l’anticorps pourrait s’accrocher) sous agitation. Ensuite, la membrane a été incubée pendant la nuit dans le tampon de blocage avec un anticorps primaire à la concentration souhaitée à 4°C sous agitation. La membrane a été lavée 3 × 5 min dans du TBS-T et incubée dans le tampon de blocage avec l’anticorps secondaire reconnaissant l’anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante. Un ECL a été réalisé. Les images ont été prises par ImageQuant LAS500 (GE Healthcare, Life Sciences, Chicago, IL, USA) et l’intensité relative des bandes de protéines a été quantifiée à l’aide d’ImageJ.

Un exemple de méthode de quantification relative du signal sur western-blot :

Immunoprécipitation

Cette technique permet d’isoler d’un extrait cellulaire une protéine et tous les interactants directs ou indirects avec cette protéine grâce à l’interaction très spécifique anticorps-antigène. Les anticorps peuvent être fixés sur des billes et on peut récupérer les complexes formés grâce à une centrifugation. Alternativement, on peut utiliser des billes qui sont ensuite attirées par un aimant. L’enrichissement de la fraction immunoprécipitée par rapport à la fraction initiale (souvent appelée input) peut être appréciée par western-blot.

Cette technique permet de savoir si deux protéines A et B appartiennent à un même complexe à un moment donné et dans des conditions données. On fait une immunoprécipitation avec un anticorps contre A et on analyse la présence par western-blot de la protéine B reconnue par un autre anticorps. Pour valider complètement l’interaction, il est préférable aussi de montrer l’inverse (immunoprécipitation de B et révélation de A).

Les protéines récupérées lors d’une immunoprécipitation peuvent aussi être analysées de manière non biaisée par spectrométrie de masse.

Si de bons anticorps ne sont pas disponibles contre une protéine donnée pour faire l’immunoprécipitation, on peut faire exprimer via des vecteurs d’expression dans les cellules ou par transgénèse dans l’embryon des protéines dites taguées avec quelques acides aminés supplémentaires qui sont reconnus par un anticorps spécifique (tag HA ou tag FLAG par exemple).

Le double-hybride

Le système du double hybride effectué chez la levure ou dans des cellules de mammifères est basé sur le nature modulaire des facteurs de transcription qui sont généralement composés de deux domaines : un domaine de liaison à l’ADN et un domaine d’activation de la transcription. Chez la levure, on utilise le facteur de transcription Gal4. Si on veut savoir si la protéine A interagit avec la protéine B, on fait synthétiser aux cellules deux protéines de fusion : une avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 fusionné avec la protéine A et une autre avec le domaine d’activation de Gal4 fusionné avec la protéine B. Ce n’est seulement dans le cas où A interagit avec B que le domaine d’activation de la transcription se trouvera à proximité du bon domaine de liaison à l’ADN et alors la transcription d’un gène rapporteur (codant la luciférase, la GFP ou une protéine indispensable à la croissance des colonies de levure) sera activée.

Immunohistochimie/Immunocytochimie/Immunofluorescence

Un exemple d’étude immunocytochimique :

L’immunochimie est basée sur la révélation d’une activité enzymatique apportée par l’anticorps secondaire alors que l’immunofluorescence est basée sur l’émission de photons à une longueur d’onde donnée d’un fluorophore couplé à l’anticorps secondaire. On peut faire plusieurs détections d’immunofluorescence sur un même échantillon à condition de bien choisir l’origine des anticorps (pas d’espèces communes pour la production des différents anticorps primaires) et les longueurs d’onde des fluorophores des anticorps secondaires.

Les progrès de la microscopie et de l’analyse des images

Les progrès scientifiques sont indissociables des progrès techniques et cela est particulièrement visible en ce qui concerne la microscopie. L’observation des cellules a bénéficié des progrès de l’optique, puis des progrès chimiques (pour les colorants), des progrès de la génétique (pour créer et introduire dans les cellules des protéines-fusion avec des protéines fluorescentes telles que la GFP), et des progrès de l’informatique (pour traiter les images).

La résolution d’un microscope photonique peut descendre jusqu’à 0,2 µm. Des objets plus petits et brillants peuvent être aperçus mais à cause d’effets de diffraction, ils apparaissent flous (selon la fonction d’étalement du point). Lorsque la lumière traverse un objet complexe les phases de ses ondes peuvent se décaler en fonction de l’indice de réfraction du milieu qu’elles traversent. C’est cette propriété qui est exploitée par le microscope à contraste de phase. Cet effet est amplifié par le microscope à contraste interférentiel. Le faisceau lumineux est dédoublé en 2 faisceaux proches l’un de l’autre par divers systèmes optiques variés avant la traversée de l’objet. Un second système optique recompose les 2 faisceaux qui produisent des interférences qui dépendent de l’épaisseur et de la biréfringence des objets observés.

En microscopie « classique » l’image nette de l’échantillon qui se trouve dans le plan focal peut être noyée dans les images floues qui proviennent de l’échantillon au-dessus ou en dessous de ce plan. Le microscope confocal permet d’éviter cet inconvénient et permet de réaliser des images nettes de très faible profondeur de champ (environ 400 nm). On peut parler de section optique. C’est possible grâce à la présence d’un petit orifice (ou sténopé) devant le détecteur dans un plan focal conjugué au plan focal de l’objectif. Il fera office de « filtre optique » ne laissant passer vers le détecteur que les photons provenant du plan de l’échantillon où l’image sera nette.

La manière dont on illumine les échantillons a aussi fait des progrès. Pour les études en fluorescence on utilise des lasers argon-ion (pour 457 nm, 488 nm, 514 nm) et hélium-néon (pour 543 nm, 633 nm).

L’angle avec lequel on illumine l’échantillon a aussi son importance comme dans la microscopie TIRF (pour Total Internal ReFlection microscopy) qui permet de ne juste voir que les molécules fluorescentes à la membrane plasmique ou juste en dessous.

Le FRAP (Redistribution de fluorescence après photoblanchiment) et le FLIP

Le photoblanchiment de la fluorescence est habituellement un problème lors de l’observation d’échantillons contenant des fluorophores. Néanmoins, on peut en tirer avantage en épuisant la fluorescence sur une région bien précise de la cellule et en observant la cinétique avec laquelle la fluorescence est restaurée dans celle-ci. La restauration proviendra forcément de l’arrivée de nouvelles molécules fluorescentes et ainsi la dynamique de diffusion ou de transports de molécules marquées avec un fluorophore peut être étudiée.

Le FLIP (ou perte de fluorescence induite par photoblanchiment) suit le principe inverse : on photoblanchie de multiples fois une zone où des protéines marquées avec un fluorochrome sont présentes et on étudie la diminution de la fluorescence ailleurs dans la cellule.

Le FRET (Transfert d’énergie entre molécules fluorescentes)

Cette technique permet de voir en microscopie si deux fluorophores se trouvent à moins de 10 nm l’un de l’autre. Pour ce faire, la longueur d’émission d’un fluorophore A doit pouvoir exciter un fluorophore B dont on pourra enregistrer l’émission de photons. Comme couple de fluorophore utilisé, on peut citer le CFP comme transmetteur d’excitation au YFP. Si ces fluorophores sont accrochés sur des protéines, on en déduira que ces protéines sont sans doute dans un même complexe et on pourra savoir dans quel compartiment de la cellule cette interaction a lieu. On peut aussi construire des biosenseurs basés sur le FRET comme dans les exemples qui suivent :

Approches optogénétiques pour perturber la signalisation cellulaire

L’optogénétique est un domaine en plein essor où la lumière à une longueur d’onde précise agit sur des protéines et change leur conformation, ce qui provoque des modifications dans la physiologie cellulaire. En neurosciences, l’ouverture ou la fermeture par la lumière de canaux ioniques permet de manipuler les dépolarisations des cellules nerveuses. Pour l’étude de la signalisation cellulaire, CRY2 (le cryptochrome 2 de la plante Arabidopsis) s’avère un outil de choix par sa capacité à s’homo-oligomériser lorsqu’il est stimulé par la lumière bleu ou à s’hétéro-dimériser avec la protéine CIB1 (Duan et al., 2017). Ainsi, à l’aide de protéines-fusion contenant CRY2 ou CIB1, on peut activer par la lumière une interaction.

De nombreuses possibilités et combinaisons peuvent être offertes pour contrôler l’activité d’une protéine et donc étudier le mécanisme de nombreux processus cellulaires du développement.

Les rapporteurs fluorescents pour la concentration calcique

Les concentrations cytoplasmiques de Ca²⁺ sont habituellement basses et l’augmentation de cette concentration par l’ouverture de canaux sur le réticulum endoplasmique ou sur la membrane plasmique augmente l’activité de certaines protéines et déclenche des cascades de signalisation.

Des molécules à la fluorescence augmentée par les ions Ca²⁺ sont devenus des outils précieux pour ce domaine de recherche. La première molécule a avoir été populaire dans les laboratoires est le Fura-2, un acide aminopolycarboxylique, découvert en 1986. Il absorbe à 340-380 nm (UV) et son émission à 510 nm dépend de la concentration calcique.

Plus récemment, une protéine fusion entre la GFP, la calmoduline (une molécule de signalisation sensible à la concentration en Ca²⁺) et M13 (une courte séquence de la kinase de la chaine légère de la myosine) a été mise au point, GCamp.

Comme c’est une protéine, on peut la faire exprimer sous le contrôle de l’ADN (et via un promoteur spécifique par exemple) dans les cellules ou les embryons.

La cytométrie du flux

Il s’agit de marquer un ou plusieurs élément.s cellulaire.s d’intérêt avec un fluorochrome (anticorps ou molécule rendue fluorescente quand elle se lie à l’ADN par exemple) puis de séparer les cellules pour les faire passer une à une sous un laser à la longueur d’onde d’excitation de la fluorescence à observer. Il y a un comptage du nombre de cellules avec telle ou telle intensité de fluorescence. Il peut y avoir un tri des cellules selon leur niveau de fluorescence, le flux pouvant être automatiquement dévié vers différents tubes en fonction des résultats obtenus. Dans ce cas-là, on parle de FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting), même si le terme de FACS s’est étendu à la méthode où on ne fait que compter les cellules.

La microscopie électronique

L’illumination de l’échantillon se fait avec un faisceau d’électrons et non pas un faisceau de photons. Les microscopes électroniques ont un pouvoir de résolution près de 1000 fois supérieur à celui des microscopes photoniques (0,2 nm contre 0,2 µm) car la longueur d’onde de De Broglie d’un électron est bien plus petite que la longueur d’onde d’un photon, même dans les UV. Les lentilles utilisées ne sont plus optiques mais électromagnétiques. La fixation de l’échantillon est le plus souvent réalisée par du glutaraldéhyde (pontage des protéines) puis du tétroxyde d’osmium (réagit avec les lipides et notamment les phospholipides des membranes biologiques, ce qui les rend plus visibles). Dans le cas particulier du microscope électronique à balayage, le faisceau d’électron très fin balaie la surface d’un échantillon qui réémet en réponse des électrons qui sont analysées et une image en 3D de l’objet observé peut être réalisée.

Les tests de migration cellulaire

Test de cicatrisation

Le test de cicatrisation liée à la blessure de tapis cellulaire consiste à arracher les cellules de manière contrôlée sur une trajectoire précise dans une boîte de Pétri et d’observer à intervalles réguliers/filmer la manière dont les cellules avoisinantes de la « blessure » vont coloniser l’espace vide. La principale composante de la cicatrisation de la blessure sera la migration cellulaire mais il peut y avoir aussi une composante liée à la prolifération. Egalement, la matrice extracellulaire peut être abimée lors de la réalisation de la blessure.

Test de migration en chambre de Boyden

Il s’agit de la création de deux compartiments avec des milieux de composition différente séparés par une membrane poreuse (en général avec des pores d’un diamètre entre 3 et 12 µm (à adapter selon les cellules étudiées)). Les cellules sont déposées sur cette membrane et on les incube durant une durée permettant à certaines d’entre elles de traverser la membrane et de se retrouver à sa face inférieure dans le second compartiment. Celui-ci peut par exemple contenir un milieu avec un chémoattractant.

Les marqueurs de prolifération

BrdU

Il s’agit d’un analogue de nucléoside qui a une structure similaire à la thymine (où il y a un -CH3 à la place du brome). Lorsqu’on met des cellules dans un milieu avec du BrdU ou qu’on l’injecte dans la circulation sanguine d’un embryon, il rentre dans les cellules et s’incorpore dans l’ADN uniquement s’il y a réplication. On replace ensuite les cellules dans un milieu sans BrdU (et il est dégradé rapidement dans un organisme). La population de cellules qui a répliqué son ADN lors de sa présence reste marquée et même si elle prolifère encore par la suite ou migre ou se différencie, on pourra toujours détecter la présence de BrdU. Cela se fait avec un anticorps spécifique et les techniques habituelles d’immunomarquage.

Ki-67 et PCNA

Pour suivre la prolifération dans un tissu, on peut également faire des immunomarquages contre des protéines qui ne sont présentes que lors des phases G1 à M mais pas en phase G0.

Ki-67 est une protéine nucléaire impliquée dans la transcription des ARN ribosomaux. Elle est exprimée tout au long du cycle de G1 à M mais est absente des cellules en G0. Durant la mitose où il n’y a plus de noyaux, elle est localisée sur les chromosomes. La protéine est nommée d’après l’anticorps dont elle s’est avérée l’antigène par la suite. L’anticorps a été produit dans la ville allemande de Kiel et était en position 67 dans une plaque de 96 puits avec divers anticorps produits contre des noyaux de lymphomes de Hodgkin.

PCNA est un facteur de processivité pour l’ADN polymérase lors de la réplication et est aussi impliqué dans la réparation de l’ADN. Son expression est très faible dans des cellules quiescentes et est fortement activé lors du passage G1/S.

L’étude du cycle cellulaire

Utilisation du FACS

Le système FUCCI

FUCCI (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator) est un ensemble de sondes fluorescentes qui permet de visualiser la progression du cycle cellulaire en temps réel dans des cellules vivantes. FUCCI utilise l’expression qui dépend de la phase du cycle cellulaire des protéines Cdt1 et Geminin. Une protéine de fusion d’un fragment de Cdt1 (acides aminés 30-120) avec la protéine fluorescente monomérique Kusabira-Orange 2 (mKO2) sert d’indicateur de la phase G1. Une protéine de fusion d’un fragment de Geminin (acides aminés 1-110 ou 1-60) avec la protéine fluorescente monomérique Azami-Green 1 (mAG1) visualise les phases S, G2 et M.

DES OUTILS POUR ANALYSER/MONTER DES IMAGES EN BIOLOGIE CELLULAIRE

L’application libre Fiji (ou ImageJ) . Lien vers des tutoriels pour utiliser Fiji (en anglais).

L’application libre Cell Profiler

AUTRES LIENS SUR LES TECHNIQUES ET OUTILS POUR LA BIOLOGIE CELLULAIRE :

Sur les différents types de microscopie : https://micro.magnet.fsu.edu/

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