Les techniques et les outils pour la biologie cellulaire

par Patrick PLA, Université Paris Saclay

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SOMMAIRE : La culture cellulaire ; Le western-blot ; L’immunoprécipitation ; Immunohistochimie/fluorescence ; Microscopie photonique ; Optogénétique ; Rapporteurs fluorescents de la concentration en Ca2+ ; La cytométrie de flux ; Microscopie électronique ; Etude de la migration cellulaire ; Etude de la prolifération du cycle cellulaire.

La culture cellulaire

La culture cellulaire in vitro concerne :

  • des cultures primaires : c’est-à-dire des cellules prélevées sur un être vivant et que l’on met en culture in vitro mais qui ne peuvent pas être maintenues sur une longue durée de temps avec une prolifération élevée,
  • des lignées cellulaires : c’est-à-dire des cellules prélevées sur un être vivant il y a longtemps et qui maintiennent des capacités de prolifération théoriquement illimitées (parce qu’elles sont cancéreuses, ou parce qu’elles ont des propriétés de cellules souches ou parce qu’elles ont été « immortalisées » en leur faisant exprimer un oncogène).

Des stocks de lignées cellulaires peuvent être conservées « indéfiniment » dans de l’azote liquide.

La culture cellulaire présente de nombreux avantages mais aussi des inconvénients. Les cellules sont dans un environnement contrôlé (température, nutriments disponibles, éventuellement matrice extracellulaire…) mais cet environnement est parfois éloigné des conditions physiologiques. Dans des cultures classiques en 2D chaque cellule est facilement visible, mais les propriétés des organisations 3D dans les tissus peuvent être perdues. Les capacités importantes de prolifération, notamment des lignées cellulaires utilisées permettent d’obtenir beaucoup de matériel pour faire des études de biochimie et facilitent les analyses statistiques mais une fois de plus les cellules ne sont pas dans leur cadre naturel et des cellules très proliférantes ne correspondent qu’à un profil particulier de cellules.

La culture cellulaire permet de diminuer le recours à l’expérimentation animale mais ne peut pas la remplacer complètement.

Les cellules sont cultivées dans un milieu nutritif contenant des nutriments et des vitamines et souvent additionné de sérum (sérum de veau foetal typiquement) dans lequel se trouvent des facteurs de croissance nécessaire à la prolifération.

Fractionnement cellulaire par centrifugation différentielle

Il s’agit d’une technique pour purifier des fractions particulières du contenu des cellules (noyau, mitochondries, ribosomes…). Elle est basée sur une série de centrifugation à des vitesses de plus en plus élevées qui permettent de précipiter des composants de plus en plus petits.

Western-blot

Présentation de la technique en vidéo :

Un exemple de protocole d’extraction de protéines et de western-Blot en détail :

Les cellules ont été lysées dans du tampon RIPA (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,25 % Na-désoxycholate, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]) contenant 1 comprimé
d’inhibiteur de protéase
et 1 comprimé d’inhibiteur de phosphatase par 10 ml. La concentration totale de protéines dans les lysats a été déterminée à l’aide d’un kit Pierce BCA Protein Assay. L’absorbance a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaque. Un gel de polyacrylamide à 8 % contenant du SDS surmonté d’un gel de stacking (pour concentrer les protéines) a été préparé. Ensuite, 15 µL de mélange d’échantillons, contenant 9 µg de protéines totales et 5 µL de tampon d’échantillon (5,7 ml d’eau, 1,6 ml de glycérol, 1,1 ml de SDS à 10 %, 1,3 ml de Tris 0,5 M (pH 6,8), 25 mg de dithiotréitol (DTT), 300 µL de bleu de bromophénol) ont été chauffés à 90 °C pendant 5 min, refroidis sur de la glace et chargé sur le gel. Le gel a été incubé dans du tampon d’électrophorèse (Tris Base 25 mM, glycine 190 mM, 0,1 % SDS) à 70 V jusqu’à ce que les échantillons atteignent le gel de séparation, puis à 150 V jusqu’à ce que les échantillons atteignent le bas du gel. Ensuite, les protéines ont été transférées sur une membrane en polyfluorure de vinylidène (PVDF) pendant 1 h à 80 V sur glace dans un tampon de transfert froid (Tris base 25 mM, glycine 190 mM, éthanol 20%). La membrane a été rincée à l’eau et lavée 2x dans une solution saline tamponnée au Tris et du Tween-20 (TBS-T) (20 mM de Tris/HCl, 137 mM de NaCl, 0,1 % de Tween-20). La membrane a été incubée pendant 1 h à température ambiante dans un tampon de blocage (5% BSA dans du TBS-T) sous agitation. Ensuite, la membrane a été incubée pendant la nuit dans le tampon de blocage avec un anticorps primaire à la concentration souhaitée à 4°C sous agitation. La membrane a été lavée 3 × 5 min dans du TBS-T et incubée dans le tampon de blocage avec l’anticorps secondaire reconnaissant l’anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante. Un ECL a été réalisé. Les images ont été prises par ImageQuant LAS500 (GE Healthcare, Life Sciences, Chicago, IL, USA) et l’intensité relative des bandes de protéines a été quantifiée à l’aide d’ImageJ.

Un exemple de méthode de quantification relative du signal sur western-blot :

Immunoprécipitation

Cette technique permet d’isoler d’un extrait cellulaire une protéine et tous les interactants directs ou indirects avec cette protéine grâce à l’interaction très spécifique anticorps-antigène. Les anticorps peuvent être fixés sur des billes et on peut récupérer les complexes formés grâce à une centrifugation. Alternativement, on peut utiliser des billes qui sont ensuite attirées par un aimant. L’enrichissement de la fraction immunoprécipitée par rapport à la fraction initiale (souvent appelée input) peut être appréciée par western-blot.

Cette technique permet de savoir si deux protéines A et B appartiennent à un même complexe à un moment donné et dans des conditions données. On fait une immunoprécipitation avec un anticorps contre A et on analyse la présence par western-blot de la protéine B reconnue par un autre anticorps. Pour valider complètement l’interaction, il est préférable aussi de montrer l’inverse (immunoprécipitation de B et révélation de A).

Les protéines récupérées lors d’une immunoprécipitation peuvent aussi être analysées de manière non biaisée par spectrométrie de masse.

Si de bons anticorps ne sont pas disponibles contre une protéine donnée pour faire l’immunoprécipitation, on peut faire exprimer via des vecteurs d’expression dans les cellules ou par transgénèse dans l’embryon des protéines dites taguées avec quelques acides aminés supplémentaires qui sont reconnus par un anticorps spécifique (tag HA ou tag FLAG par exemple).

Immunohistochimie/Immunocytochimie/Immunofluorescence

Un exemple d’étude immunocytochimique :

*Un exemple d’immunohistochimie sur un embryon de poulet pour reconnaître les cellules de crêtes neurales (anticorps primaire HNK-1 (en vert) qui reconnaît un antigène à la surface de ces cellules). La fixation est réalisée avec du paraformaldéhyde (PFA) 4%. La perméabilisation fait appel à des détergents non ioniques comme le Tween 20 ou le Triton X-100. L’anticorps primaire (vert) reconnait spécifiquement l’antigène (triangle vert). L’anticorps secondaire (rouge) reconnaît le premier anticorps (il doit être choisi pour reconnaître les anticorps de l’espèce où a été produit l’anticorps primaire) et il est couplé à la péroxidase qui en présence de DAB et d’H202 donne un produit coloré brun.

L’immunochimie est basée sur la révélation d’une activité enzymatique apportée par l’anticorps secondaire alors que l’immunofluorescence est basée sur l’émission de photons à une longueur d’onde donnée d’un fluorophore couplé à l’anticorps secondaire. On peut faire plusieurs détections d’immunofluorescence sur un même échantillon à condition de bien choisir l’origine des anticorps (pas d’espèces communes pour la production des différents anticorps primaires) et les longueurs d’onde des fluorophores des anticorps secondaires.

Les progrès de la microscopie et de l’analyse des images

Les progrès scientifiques sont indissociables des progrès techniques et cela est particulièrement visible en ce qui concerne la microscopie. L’observation des cellules a bénéficié des progrès de l’optique, puis des progrès chimiques (pour les colorants), des progrès de la génétique (pour créer et introduire dans les cellules des protéines-fusion avec des protéines fluorescentes telles que la GFP), et des progrès de l’informatique (pour traiter les images).

*Trajet optique d’un microscope droit. On peut éclairer l’échantillon par dessous (Diascope) ou par dessus (Episcope) dans le modèle présenté. Source : https://www.naturoptic.com/comment-choisir/microscopes/microscope.php
*Trajet optique d’un microscope inversé. On appelle ce type de microscope inversé car les objectifs se trouvent sous l’échantillon et non pas au-dessus. Cela permet notamment d’observer les cellules dans des boites de culture cellulaire où les cellules sont recouvertes de milieu. Source : https://www.naturoptic.com/comment-choisir/microscopes/microscope.php

La résolution d’un microscope photonique peut descendre jusqu’à 0,2 µm. Des objets plus petits et brillants peuvent être aperçus mais à cause d’effets de diffraction, ils apparaissent flous (selon la fonction d’étalement du point). Lorsque la lumière traverse un objet complexe les phases de ses ondes peuvent se décaler en fonction de l’indice de réfraction du milieu qu’elles traversent. C’est cette propriété qui est exploitée par le microscope à contraste de phase. Cet effet est amplifié par le microscope à contraste interférentiel. Le faisceau lumineux est dédoublé en 2 faisceaux proches l’un de l’autre par divers systèmes optiques variés avant la traversée de l’objet. Un second système optique recompose les 2 faisceaux qui produisent des interférences qui dépendent de l’épaisseur et de la biréfringence des objets observés.

**Trajet des rayons lumineux dans un microscope à contraste interférentiel différentiel. Source : DIC_Light_Path.png: Richard Wheeler (Zephyris)

En microscopie « classique » l’image nette de l’échantillon qui se trouve dans le plan focal peut être noyée dans les images floues qui proviennent de l’échantillon au-dessus ou en dessous de ce plan. Le microscope confocal permet d’éviter cet inconvénient et permet de réaliser des images nettes de très faible profondeur de champ (environ 400 nm). On peut parler de section optique. C’est possible grâce à la présence d’un petit orifice (ou sténopé) devant le détecteur dans un plan focal conjugué au plan focal de l’objectif. Il fera office de « filtre optique » ne laissant passer vers le détecteur que les photons provenant du plan de l’échantillon où l’image sera nette.

La manière dont on illumine les échantillons a aussi fait des progrès. Pour les études en fluorescence on utilise des lasers argon-ion (pour 457 nm, 488 nm, 514 nm) et hélium-néon (pour 543 nm, 633 nm).

L’angle avec lequel on illumine l’échantillon a aussi son importance comme dans la microscopie TIRF (pour Total Internal ReFlection microscopy) qui permet de ne juste voir que les molécules fluorescentes à la membrane plasmique ou juste en dessous.

***Microscopie à réflexion interne totale (TIRF). (A) Schéma du trajet lumineux pendant la microscopie TIRF. Le laser d’excitation sort de l’objectif à un angle tel qu’il est complètement réfléchi à l’interface verre-liquide formée par la lamelle de verre et l’environnement aqueux des cellules dans le milieu.
La réflexion de la lumière laser produit un champ électromagnétique connu sous le nom d’onde évanescente, qui diminue de façon exponentielle. Il est
seulement assez puissant pour exciter les fluorophores (cercles verts) dans une couche mince d’environ 100-200 nm au-dessus de la lamelle, laissant
les fluorophores à d’autres emplacements cellulaires non excités (cercles gris). (B) Le même champ de vision, imagé en microscopie « normale » ou en
microscopie TIRF, d’une cellule d’ostéosarcome exprimant paxilline-GFP. Barre d’échelle = 2 µm. Source : https://www.mdpi.com/2079-7737/10/11/1189
Le FRAP (Redistribution de fluorescence après photoblanchiment) et le FLIP

Le photoblanchiment de la fluorescence est habituellement un problème lors de l’observation d’échantillons contenant des fluorophores. Néanmoins, on peut en tirer avantage en épuisant la fluorescence sur une région bien précise de la cellule et en observant la cinétique avec laquelle la fluorescence est restaurée dans celle-ci. La restauration proviendra forcément de l’arrivée de nouvelles molécules fluorescentes et ainsi la dynamique de diffusion ou de transports de molécules marquées avec un fluorophore peut être étudiée.

Le FLIP (ou perte de fluorescence induite par photoblanchiment) suit le principe inverse : on photoblanchie de multiples fois une zone où des protéines marquées avec un fluorochrome sont présentes et on étudie la diminution de la fluorescence ailleurs dans la cellule.

**Principe du FLIP. D’après https://fr.wikipedia.org/wiki/Perte_de_fluorescence_induite_par_photoblanchiment#/media/Fichier:Fluorescence_Loss_in_Photobleaching_Schematic.jpg
***Analyse FLIP de la mobilité de la GFP:MEX-5 dans un zygote de C. elegans. Expériences FLIP sur des zygotes de C. elegans au stade de la réunion des pronucléi. (A) Les embryons exprimant la GFP, la protéine de fusion NMY-2:GFP ou la protéine de fusion GFP:MEX-5 (avec MEX5 sauvage ou avec diverses mutations (S458A ou DZF1+ZF2) ont été photo-blanchis près du pôle postérieur (astérisque) pendant le nombre de cycles indiqué. (B) Fluorescence mesurée au pôle antérieur (ligne pleine) et au pôle postérieur (ligne pointillée) pour des embryons uniques après chaque cycle de photoblanchiment pour la GFP ou les protéines de fusion GFP:MEX-5 indiquées. La perte de fluorescence postérieure est moindre pour la GFP et la GFP:MEX-5 mutée que pour les autres protéines, probablement parce qu’une plus grande fraction de la protéine antérieure non blanchie se déplace vers l’arrière. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/135/22/3665/76427/MEX-5-asymmetry-in-one-cell-C-elegans-embryos
Le FRET (Transfert d’énergie entre molécules fluorescentes)

Cette technique permet de voir en microscopie si deux fluorophores se trouvent à moins de 10 nm l’un de l’autre. Pour ce faire, la longueur d’émission d’un fluorophore A doit pouvoir exciter un fluorophore B dont on pourra enregistrer l’émission de photons. Comme couple de fluorophore utilisé, on peut citer le CFP comme transmetteur d’excitation au YFP. Si ces fluorophores sont accrochés sur des protéines, on en déduira que ces protéines sont sans doute dans un même complexe et on pourra savoir dans quel compartiment de la cellule cette interaction a lieu. On peut aussi construire des biosenseurs basés sur le FRET comme dans les exemples qui suivent :

*Un biosenseur de l’activité Cdc42 basé sur le FRET. (A) Une protéine chimérique rassemblant Cdc42 et PAK ainsi que CFP à une extrémité et YFP à une autre extrémité est construite. Lorsque Cdc42 n’est pas active (attaché à un GDP) la protéine a une conformation où le FRET ne peut pas fonctionner. Lorsque Cdc42 est activée (liée au GTP), elle interagit avec PAK provoquant un changement de conformation qui amène CFP à proximité de YFP et un FRET se réalise. L’émission à 530 nm de YFP sera donc une indication de l’activation de Cdc42. (B) Quelques exemples de mesure avec un jeune neurone en présence ou non de nétrine et agrandissement de son cône de croissance. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0159405
*Biosenseur de l’activité ERK basé sur le FRET. La phosphorylation de la thréonine 48 de Cdc25c par ERK provoque une liaison avec le domaine WW et la nouvelle conformation de la protéine chimérique permet le FRET entre les deux fluorophores. Source : https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.0804598105

Approches optogénétiques pour perturber la signalisation cellulaire

L’optogénétique est un domaine en plein essor où la lumière à une longueur d’onde précise agit sur des protéines et change leur conformation, ce qui provoque des modifications dans la physiologie cellulaire. En neurosciences, l’ouverture ou la fermeture par la lumière de canaux ioniques permet de manipuler les dépolarisations des cellules nerveuses. Pour l’étude de la signalisation cellulaire, CRY2 (le cryptochrome 2 de la plante Arabidopsis) s’avère un outil de choix par sa capacité à s’homo-oligomériser lorsqu’il est stimulé par la lumière bleu ou à s’hétéro-dimériser avec la protéine CIB1 (Duan et al., 2017). Ainsi, à l’aide de protéines-fusion contenant CRY2 ou CIB1, on peut activer par la lumière une interaction.

**Utilisation de l’optogénétique pour perturber la signalisation cellulaire et indirectement le cytosquelette. Des embryons de drosophile transgéniques sont produits où la protéine fusion CIBN :: pmGFP se localise sur la membrane plasmique et CRY2 est fusionné à Cherry et à la 5-ptase = Phosphoinositide 5 phosphatase (mCh::Cry2::5-ptaseOCRL). En l’absence de lumière bleue (488 nm), CRY2 et CIB1 n’interagissent pas, donc la 5-ptase reste localisée dans le cytosol. Lors d’une illumination avec un laser à 488 nm, CRY2 et CIB1 interagissent, la 5-ptase se relocalise à la membrane plasmique et fait diminuer la quantité de PI(4,5)P2 en le déphosphorylant en PI(4)P. Cela entraîne une déplétion d’actine, blocage de la contractilité cellulaire et inhibition des mouvements morphogénétiques lors de la gastrulation des embryons de drosophile. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580715006851

De nombreuses possibilités et combinaisons peuvent être offertes pour contrôler l’activité d’une protéine et donc étudier le mécanisme de nombreux processus cellulaires du développement.

**Le contrôle de la localisation et de l’activité des protéines à l’aide de l’optogénétique. Dans tous les cas, les photorécepteurs sont représentés en bleu, leurs partenaires de liaison en vert et les protéines d’intérêt en gris. (A) La dimérisation des protéines induite par la lumière peut être utilisée pour recruter une protéine d’intérêt à un emplacement intracellulaire spécifique, où elle peut poursuivre sa fonction. (B) L’oligomérisation dépendante de la lumière (clustering) peut induire des hubs de signalisation fonctionnels actifs ou inhiber la fonction des protéines. (C) La dimérisation induite par la lumière peut également être adoptée pour séquestrer une protéine d’intérêt loin de son site d’action. (D) Le photo-uncaging basée sur les propriétés des domaines LOV peut être utilisée pour contrôler directement l’activité des protéines avec la lumière. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/20/dev175067/224396/Principles-and-applications-of-optogenetics-in

Les rapporteurs fluorescents pour la concentration calcique

Les concentrations cytoplasmiques de Ca2+ sont habituellement basses et l’augmentation de cette concentration par l’ouverture de canaux sur le réticulum endoplasmique ou sur la membrane plasmique augmente l’activité de certaines protéines et déclenche des cascades de signalisation.

Des molécules à la fluorescence augmentée par les ions Ca2+ sont devenus des outils précieux pour ce domaine de recherche. La première molécule a avoir été populaire dans les laboratoires est le Fura-2, un acide aminopolycarboxylique, découvert en 1986. Il absorbe à 340-380 nm (UV) et son émission à 510 nm dépend de la concentration calcique.

*Intensité de la fluorescence du Fura-2 en fonction des concentrations de Ca2+ et des longueurs d’onde d’excitations (abscisses). Source : https://www.scbt.com/fr/p/fura-2-am-108964-32-5

Plus récemment, une protéine fusion entre la GFP, la calmoduline (une molécule de signalisation sensible à la concentration en Ca2+) et M13 (une courte séquence de la kinase de la chaine légère de la myosine) a été mise au point, GCamp.

**Structure de la protéine-chimère GCamp en présence de Ca2+. CaM = calmoduline, cpEGFP = une forme optimisée de la GFP et M13 = courte séquence de la kinase de la chaine légère de la myosine pour faire la liaison. En absence de Ca2+, la conformation est un peu différente, empêchant cpEGFP d’avoir une fluorescence significative. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)32673-9/fulltext

Comme c’est une protéine, on peut la faire exprimer sous le contrôle de l’ADN (et via un promoteur spécifique par exemple) dans les cellules ou les embryons.

**La concentration de Ca2+ dans le cil des cellules dans la périphérie du nœud de Hensen durant la mise en place de l’asymétrie gauche/droite chez la souris. GCamp6 est exprimé fusionné avec une séquence d’adressage dans le cil. Ainsi, sa fluorescence ne fluctue que selon les concentrations de Ca2+ dans ce compartiment. On observe que la fluorescence est plus importante du côté gauche, ce qui est en accord avec l’hypothèse d’une activation de la signalisation ciliaire de ce côté qui serait à l’origine de l’asymétrie. R = droite; L = gauche. Source : https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aba1195

La cytométrie du flux

Il s’agit de marquer un ou plusieurs élément.s cellulaire.s d’intérêt avec un fluorochrome (anticorps ou molécule rendue fluorescente quand elle se lie à l’ADN par exemple) puis de séparer les cellules pour les faire passer une à une sous un laser à la longueur d’onde d’excitation de la fluorescence à observer. Il y a un comptage du nombre de cellules avec telle ou telle intensité de fluorescence. Il peut y avoir un tri des cellules selon leur niveau de fluorescence, le flux pouvant être automatiquement dévié vers différents tubes en fonction des résultats obtenus. Dans ce cas-là, on parle de FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting), même si le terme de FACS s’est étendu à la méthode où on ne fait que compter les cellules.

*Principe du tri cellulaire guidé par fluorescence (FACS). Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Cytom%C3%A9trie_en_flux#/media/Fichier:Fluorescence_Activated_Cell_Sorting_(FACS)_principle.tif

La microscopie électronique

L’illumination de l’échantillon se fait avec un faisceau d’électrons et non pas un faisceau de photons. Les microscopes électroniques ont un pouvoir de résolution près de 1000 fois supérieur à celui des microscopes photoniques (0,2 nm contre 0,2 µm) car la longueur d’onde de De Broglie d’un électron est bien plus petite que la longueur d’onde d’un photon, même dans les UV. Dans le cas particulier du microscope électronique à balayage, le faisceau d’électron très fin balaie la surface d’un échantillon qui réémet en réponse des électrons qui sont analysées et une image en 3D de l’objet observé peut être réalisée.

Les tests de migration cellulaire

Test de cicatrisation

Le test de cicatrisation liée à la blessure de tapis cellulaire consiste à arracher les cellules de manière contrôlée sur une trajectoire précise dans une boîte de Pétri et d’observer à intervalles réguliers/filmer la manière dont les cellules avoisinantes de la « blessure » vont coloniser l’espace vide. La principale composante de la cicatrisation de la blessure sera la migration cellulaire mais il peut y avoir aussi une composante liée à la prolifération. Egalement, la matrice extracellulaire peut être abimée lors de la réalisation de la blessure.

*Analyse de la migration des cellules de mélanome M3 par essai de cicatrisation in vitro. (A) Images de microscopie de la fermeture de la blessure d’un tapis de cellules de mélanome non traitées (images de gauche) et traitées avec de la chloroquine (CQ, 25 µM, images de droite) à 0, 10 et 20 h après la réalisation de la blessure. Les lignes pointillées définissent la zone dépourvue de cellules. Barres d’échelle, 100 µm. (B) Quantification de la zone blessée envahie pendant 20 h par des cellules de mélanome non traitées (vert) et par des cellules de mélanome traitées CQ (rouge) présentées en unités relatives (r.u.). Les résultats représentent la moyenne de quatre mesures de chaque zone blessée, obtenues dans 3 expériences indépendantes (n = 12). Les valeurs moyennes de la fermeture relative de la plaie et les limites de confiance correspondantes (α = 0,05, lignes ombrées) sont tracées. La ligne pointillée marque le moment où commencent les différences significatives. (C) Analyse de la vitesse du front cellulaire dans les cellules de mélanome non traitées et traitée par CQ. Moyenne ± SD de 3 expériences indépendantes (n = 12). (D) Quantification de la zone de vitesse de guérison (μm2/h) pendant 20 h dans des cellules non traitées et traitées (n = 12). Les lignes pointillées marquent la moyenne de la zone de vitesse de guérison dans chaque traitement. (E) Graphique montrant l’analyse quantitative de la zone de vitesse de guérison moyenne (μm2/h) des cellules de mélanome non traitées et traitées (CQ); moyenne ± SD, (n = 12), à partir de 3 expériences indépendantes. Les valeurs p obtenues par le test t de Student bilatéral non apparié sont indiquées dans les graphiques (C, E). Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2019.00107/full
Test de migration en chambre de Boyden

Il s’agit de la création de deux compartiments avec des milieux de composition différente séparés par une membrane poreuse (en général avec des pores d’un diamètre entre 3 et 12 µm (à adapter selon les cellules étudiées)). Les cellules sont déposées sur cette membrane et on les incube durant une durée permettant à certaines d’entre elles de traverser la membrane et de se retrouver à sa face inférieure dans le second compartiment. Celui-ci peut par exemple contenir un milieu avec un chémoattractant.

Protocole de la chambre de Boyden proposé par un fabricant. Source : https://www.merckmillipore.com/FR/fr/life-science-research/antibodies-assays/assays-overview/cell-invasion-migration-assays/boyden-chamber-technique/I0qb.qB.KSMAAAFANtY.1ZcQ,nav

Les marqueurs de prolifération

BrdU
Bromodeoxyuridine - Wikipedia
*BrdU ou bromodésoxyuridine

Il s’agit d’un analogue de nucléoside qui a une structure similaire à la thymine (où il y a un -CH3 à la place du brome). Lorsqu’on met des cellules dans un milieu avec du BrdU ou qu’on l’injecte dans la circulation sanguine d’un embryon, il rentre dans les cellules et s’incorpore dans l’ADN uniquement s’il y a réplication. On replace ensuite les cellules dans un milieu sans BrdU (et il est dégradé rapidement dans un organisme). La population de cellules qui a répliqué son ADN lors de sa présence reste marquée et même si elle prolifère encore par la suite ou migre ou se différencie, on pourra toujours détecter la présence de BrdU. Cela se fait avec un anticorps spécifique et les techniques habituelles d’immunomarquage.

Ki-67 et PCNA

Pour suivre la prolifération dans un tissu, on peut également faire des immunomarquages contre des protéines qui ne sont présentes que lors des phases G1 à M mais pas en phase G0.

Ki-67 est une protéine nucléaire impliquée dans la transcription des ARN ribosomaux. Elle est exprimée tout au long du cycle de G1 à M mais est absente des cellules en G0. Durant la mitose où il n’y a plus de noyaux, elle est localisée sur les chromosomes. La protéine est nommée d’après l’anticorps dont elle s’est avérée l’antigène par la suite. L’anticorps a été produit dans la ville allemande de Kiel et était en position 67 dans une plaque de 96 puits avec divers anticorps produits contre des noyaux de lymphomes de Hodgkin.

PCNA est un facteur de processivité pour l’ADN polymérase lors de la réplication et est aussi impliqué dans la réparation de l’ADN. Son expression est très faible dans des cellules quiescentes et est fortement activé lors du passage G1/S.

L’étude du cycle cellulaire

Utilisation du FACS
**Des cellules n’exprimant plus Rb, p107 et p130 passent massivement en phase S même en absence de facteurs de croissance. Des cultures de fibroblastes provenant de souris sauvages (wt) ou homozygotes pour des mutations perte-de-fonction p107-/-;p130-/-  ou Rb-/- ou p107-/-;p130-/-;Rb-/- (=TKO pour triple knock-out) sont cultivées en presence de sérum qui contient des facteurs de croissance (A) ou en son absence (B). Les phases de leur cycle cellulaire sont observées en FACS après coloration de l’ADN à l’iodure de propidium. En A à gauche, le premier pic correspond aux cellules n’ayant pas repliqué leur ADN, le second pic à celles qui ont repliqué leur ADN mais ne se sont pas encore divisées (en phase G2 ou en mitose avant la cytodiérèse). Les cellules avec une fluorescence intermédiaire sont en phase S en train de répliquer leur ADN. Le pourcentage de cellules en phase S cellulaire est indiqué, avec des écarts types (+/-). On constate qu’en présence de facteurs de croissance une proportion nettement plus importantes de cellules TKO sont en phase S que les autres cellules mais semblent bloquées à ce stade car on ne voit pas de pic correspondant aux cellules G2/M. En absence de facteurs de croissance, cette tendance est même amplifiée et on voit également que les autres mutants ont plus de réplication et de mitoses que les wt. Source : http://m.genesdev.cshlp.org/content/14/23/3037/F4.expansion.html
Le système FUCCI

FUCCI (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator) est un ensemble de sondes fluorescentes qui permet de visualiser la progression du cycle cellulaire en temps réel dans des cellules vivantes. FUCCI utilise l’expression qui dépend de la phase du cycle cellulaire des protéines Cdt1 et Geminin. Une protéine de fusion d’un fragment de Cdt1 (acides aminés 30-120) avec la protéine fluorescente monomérique Kusabira-Orange 2 (mKO2) sert d’indicateur de la phase G1. Une protéine de fusion d’un fragment de Geminin (acides aminés 1-110 ou 1-60) avec la protéine fluorescente monomérique Azami-Green 1 (mAG1) visualise les phases S, G2 et M.

*Coloration des phases du cycle cellulaire dans le système FUCCI. Source : https://www.mblintl.com/resources/learning-center/technologies/drug-discovery/cell-cycle-indicator/

DES OUTILS POUR ANALYSER/MONTER DES IMAGES EN BIOLOGIE CELLULAIRE

L’application libre Fiji (ou ImageJ) . Lien vers des tutoriels pour utiliser Fiji (en anglais).

L’application libre Cell Profiler

AUTRES LIENS SUR LES TECHNIQUES ET OUTILS POUR LA BIOLOGIE CELLULAIRE :

Sur les différents types de microscopie : https://micro.magnet.fsu.edu/

LIEN VERS LE GLOSSAIRE