Exercices sur l’ovogenèse, la spermatogenèse et la fécondation

Niveaux de difficulté : * = embryon; ** = têtard; *** = mature

EXERCICE 1 :

**Dans certains cas, l’ICSI échoue à donner un embryon. Parmis ces échecs, les chercheurs ont trouvé des cas où PLC-ζ n’est pas exprimé ou n’est pas fonctionnelle chez les hommes dont on a utilisé les spermatozoïdes. Expliquez pourquoi cela peut causer l’échec de l’ICSI. Comment y remédier tout en continuant à utiliser les spermatozoïdes des mêmes hommes ?

EXERCICE 2 :

Le gène WT1 code un facteur de transcription exprimé (entre autres) dans les cellules folliculaires. Des femmes infertiles portent une mutation à l’état hétérozygote dans la séquence codante de WT1 changeant l’arginine en position 394 en tryptophane. On produit des lignées de souris reproduisant la mutation wt1_^+/R394W. (A, D) On étudie des coupes d’ovaires de souris tout juste mature sexuellement. (E) Quantification par ovaire du nombre de follicules primordiaux et du nombre de follicules primaires chez les souris sauvages et mutantes. Source : doi:10.1093/hmg/ddt423

*2.1 Comment peut-on qualifier la mutation qui affecte les patientes ?

*2.2 En observant les coupes histologiques (A-D), quelles différences peut-on observer entre les ovaires des souris sauvages et des souris mutantes ?

*2.3 Que déduisez-vous des quantifications en E ? Comment pourrait alors s’expliquer la stérilité des femmes porteuses de la mutation ?

EXERCICE 3

Extrait du sujet de Bac STL 2012

En 2004, des scientifiques ont étudié, chez un groupe d’une quinzaine d’hommes volontaires, l’effet d’implants sous-cutanés contenant de la testostérone. Les implants ont été renouvelés toutes les douze semaines.
Trois paramètres ont été étudiés pendant 48 semaines :
la concentration plasmatique en hormone lutéinisante (LH), la concentration plasmatique en hormone folliculostimulante (FSH) et le pourcentage d’infertilité.
Aucun effet secondaire n’a été observé chez les sujets ni pendant, ni après l’expérience.

*3.1 Analysez et expliquez les résultats obtenus concernant les concentrations plasmatiques de LH et de FSH.

*3.2 Comment évolue la fertilité des hommes traités. Proposez une explication.

EXERCICE 4

On cherche à étudier le rôle de la protéine MLX qui est un facteur de transcription dont l’activité dépend de la disponibilité en glucose. Le gène Mlx est délété dans les cellules de Sertoli grâce à un système Cre/Lox avec la Cre sous le contrôle du promoteur du gène codant AMH. On réalise des coupes de testicule sur des souris adultes mâles dites sauvages (WT testis) ou mutantes (KO testis) et on les colore au DAPI (bleu) ou avec une immunofluorescence reconnaissant SOX9 exprimé dans les cellules de Sertoli (vert). A gauche, n’a été utilisé que l’anticorps secondaire et pas l’anticorps primaire. Barre d’échelle = 400 µm. La fertilité des mâles est testée par des croisements et les mâles sont pesés (fl/fl = WT; fl/fl+Amh-Cre = KO). Source : https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3001085

*4.1 : Justifiez l’utilisation du système Cre/Lox avec la Cre sous le contrôle du promoteur du gène codant l’AMH pour déléter Mlx dans les cellules de Sertoli.

*4.2 : Analysez et interprétez les résultats.

EXERCICE 5

DCST1 et DCST2 sont deux protéines présentes à la membrane plasmique des spermatozoïdes (spzdes). Des spzdes sauvages (Ctrl) et mutants perte-de-fonction pour Dcst1 (Dcst1^d1/d1) et Dcst2 (Dcst2^d25/d25) sont mis en incubation avec des ovocytes (A) pendant 30 min puis on « lave » les spzdes non accrochés à l’ovocyte. En B, on étudie par western-blot l’expression de IZUMO1 et de SLC2A3 dans les cellules germinales testiculaires (TGC) et dans les spermatozoïdes. SLC2A3 est un transporteur de glucose très exprimé dans le flagelle des spzdes et il est utilisé comme contrôle de dépot. Source : https://www.nature.com/articles/s42003-022-03289-w

*5.1 Que constate-t-on sur les photos en A ?

*5.2 Quel est la localisation et le rôle de la protéine IZUMO ? Qu’observe-t-on concernant son expression dans les spzdes avec les différents génotypes ?

(C) On réalise une immunofluorescence avec des anticorps qui reconnaissent IZUMO (vert) sur des spermatozoïdes incubés en présence d’ovocytes. Il n’y a pas d’étape de perméabilisation pour cette immunofluorescence. (D) On compte le nombre de spzdes qui ont réalisé la réaction acrosomiale et attaché à la membrane plasmique de l’ovocyte. Source : https://www.nature.com/articles/s42003-022-03289-w

*5.3 Analysez les résultats en C.

*5.4 Analysez les résultats en D et proposez des hypothèses pour les expliquer.

On incube les ovocytes avec du Hoechst33342 qui marque l’ADN (en bleu) puis on lave le Hoechst33342 et on met en présence l’ovocyte avec les différents types de spzdes. Source : https://www.nature.com/articles/s42003-022-03289-w

**5.5 Analysez et interprétez l’expérience présentée en E.

*5.6 Que nous confirme les résultats en F ?

REPONSES :

1 : Lors d’une ICSI, on introduit la tête d’un spermatozoïde dans le cytoplasme de l’ovocyte. PLC-ζ se trouve normalement dans le cytoplasme de la tête du spermatozoïde et passe dans le cytoplasme de l’ovocyte. Cette phospholipase clive PI(4,5)P2 et permet de produire IP3 (inositol-triphosphate) qui active le sortie du Ca²⁺ du réticulum endoplasmique vers le cytosol. Ce Ca²⁺ est nécessaire à l’activation de l’ovocyte et au démarrage du développement embryonnaire. Sans cette PLC-ζ, l’ICSI est un échec. Pour remédier au problème, on pourrait utiliser des ionophores à Ca²⁺ c’est-à-dire des molécules qui perméabilisent la membrane plasmique de l’ovocyte à Ca²⁺ permettant ainsi d’activer l’ovocyte et d’enclencher la suite du développement (c’est une technique qui existe et qui s’appelle l’activation assistée de l’ovocyte).

2.1 : C’est une mutation dominante car un seul allèle muté provoque un phénotype. 2.2 : En A et B, on constate que les ovaires des souris mutées sont plus petits que les ovaires des souris sauvages. Cela est dû à un nombre de follicules qui parait plus faible. Quand on regarde à plus fort grossissement, on observe que les cellules folliculaires autour des ovocytes sont bien ordonnées chez les souris sauvages alors que l’organisation est plus désordonnée chez les souris mutées. 2.3 : Le nombre de follicules primordiaux n’est pas statistiquement différent entre les souris sauvages et mutées ce qui indique que le développement embryonnaire s’est passé normalement et que le début de la folliculogenèse n’a pas été affecté. En revanche, il y a significativement moins de follicules primaires chez les souris mutées. Cela indique que la mutation de WT1 a bloqué le développement des follicules au stade primordial. La stérilité des femmes pourrait être expliqué par le fait que les follicules n’arrivent pas à maturer à partir de la puberté (où, normalement, régulièrement, une cohorte de follicules commence leur maturation jusqu’à ce qu’il y en ait un qui domine les autres et permette l’ovulation). Les follicules restent dans un état immature.

3.1 : Les taux de LH et de FSH baissent drastiquement à cause du rétrocontrôle négatif exercé par la testostérone dans l’adénohypophyse. 3.2 : La fertilité baisse et est complètement nulle au bout de 12 semaines. Cela peut s’expliquer par le fait que l’inhibition de la production de FSH aboutit à moins stimuler les cellules de Sertoli qui aident la spermatogenèse à s’accomplir (la production de testostérone par les cellules de Leydig sous la stimulation de la LH est abolie car la concentration de LH devient nulle mais l’implant permet un bon apport de testostérone donc ce n’est pas cela l’origine de l’infertilité).

4.1 : L’AMH est une hormone qui est produite spécifiquement par les cellules de Sertoli et pas par d’autres cellules somatiques ou les cellules germinales dans les testicules. Ainsi, le gène Mlx flanqué de séquences Lox ne sera délété par la Cre que dans les cellules de Sertoli. 4.2 : On constate que les souris mâles sans Mlx dans leurs cellules de Sertoli sont complètement stériles mais ce n’est pas dû à un retard général de croissance puisque leur poids est normal. Sur les coupes des mutants, on observe des tubes séminifères avec un grand nombre de cellules de Sertoli mais pas d’autres cellules (dont le noyau aurait pu être marqué par le DAPI). On en conclut qu’il y a un grand déficit en cellules germinales ce qui peut expliquer la stérilité. Sachant que le gène Mlx a été délété uniquement dans les cellules de Sertoli, on met ici en évidence un effet non-cellulaire autonome des cellules de Sertoli sur les cellules germinales. Il y a aussi un effet cellulaire autonome avec des cellules de Sertoli plus nombreuses dû à une plus forte prolifération (ou une moindre apoptose).

5.1 : Les spzdes sans DCST1 ou sans DCST2 sont capables de s’accrocher aux ovocytes (leur zone pellucide ou leur membrane plasmique, on ne peut pas le distinguer). 5.2 : IZUMO est localisé à la membrane de l’acrosome puis après la réaction acrosomiale (ou acrosomique), à la membrane plasmique. Cette protéine interagit avec JUNO qui se trouve à la membrane plasmique de l’ovocyte et cette interaction est nécessaire à la fusion entre les membranes plasmiques des 2 gamètes. On n’observe pas de différences notables dans l’expression d’IZUMO démontrant que ni DCST1, ni DCST2 ne sont indispensables pour son expression. 5.3 : Le fait de voir IZUMO en immunofluorescence sans perméabilisation veut dire que la réaction acrosomiale a eu lieu car elle est nécessaire pour que IZUMO soit à la membrane plasmique et donc détectable par un anticorps dans ces conditions. On constate que les spzdes mutants n’ont aucun problème notable à réaliser la réaction acrosomiale. Soit ni DCST1, ni DCST2 sont impliqués dans ce processus, soit l’absence de l’un peut être compensé par l’autre. 5.4 : Il y a en moyenne plus de spzdes mutants accrochés à la membrane plasmique de l’ovocyte que de spzdes sauvages. Cela peut vouloir dire que DCST1 et DCST2 diminuent les capacités de fixation des spzdes à la membrane plasmique de l’ovocyte ou alors que DCST1 ou DCST2 sont nécessaires pour l’étape suivante et que le blocage de la polyspermie n’a pas été enclenché permettant à de multiples spermatozoïdes de s’accrocher à la membrane plasmique de l’ovocyte. 5.5 : On observe le marquage Hoechst dans le pronucléus de l’ovocyte mais aussi chez le contrôle dans le pronucléus mâle (flèche). Ce dernier marquage ne correspond pas au noyau d’un spzde resté à l’extérieur puisque le Hoechst n’est plus présent lors de la fécondation et donc l’ADN du spzde doit être dans l’ovocyte pour pouvoir être marqué. On n’observe pas de marquage autre que celui du noyau femelle dans les ovocytes fécondés avec les spzdes mutants. On en déduit qu’il n’y a pas eu de fusion entre les spzdes mutants et les ovocytes. 5.6 : Ces données nous permettent de confirmer que DCST1 ou DCST2 sont nécessaires pour la fusion entre spzdes et ovocytes.

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