Exercices sur les matrices extracellulaires, le cytosquelette et les adhérences cellule-cellule

Niveaux de difficulté : * = embryon; ** = têtard; *** = mature

EXERCICE 1 :

Des images ont été prises de tests de fermeture de cicatrisation de tapis de cellules trophoblastiques HTR8/SVneo cultivées dans un milieu sans sérum complété par le solvant (panneaux supérieurs) ou les peptides RGD et YIGSR (panneaux inférieurs). Chaque condition de culture a été en outre traitée sans (milieu sans sérum) ou avec des microvésicules produites par des cellules ES ou du sérum à 1 %. La ligne pointillée indique la largeur de la plaie d’origine. Barre d’échelle, 250 μm. (f) Les résultats en e ont été quantifiés et tracés en tant que zone relative de plaie ouverte. Toutes les valeurs affichées sont présentées sous forme de moyenne ± s.e.m. (n≥3 expériences indépendantes pour chaque dosage). Les différences ont été analysées à l’aide du test t de Student ; *P<0,05, **P<0,01. Source : https://www.nature.com/articles/ncomms11958

* 1.1 Rappelez le principe du test de cicatrisation. Quels sont les processus cellulaires à l’œuvre ?

*1.2 Quelle est la fonction des peptides RGD dans l’expérience ?

*1.3 Sachant que YIGSR est la séquence sur la laminine reconnue par les intégrines, interprétez les résultats de l’expérience.

EXERCICE 2 :

On cultive des cellules Ishikawa (des cellules de carcinomes d’endomètre utérin) dans un milieu contrôle ou additionné d’un mélange de 17β-estradiol et de progestérone (E2P4) ou d’acide suberoylanilique hydroxamique (SAHA) qui est connu dans ce modèle pour faciliter l’attachement de sphéroïdes JAR (des cellules de choriocarcinomes qui miment les cellules trophoblastiques d’un embryon qui doit s’implanter). Une immunofluorescence anti-E-cadhérine et anti-N-cadhérine est effectuée ainsi qu’une coloration avec de la phalloïdine couplée à un fluorochrome. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)48101-3/fulltext

**2.1 Les cellules dans la rangée du haut sont observées en microscopie DIC (microscopie à contraste interférentiel). Expliquez comment cela fonctionne.

*2.2 Analysez et interprétez les immunofluorescences anti-E-cadhérine et anti-N-cadhérine.

*2.3 Que marque la phalloïdine ?

*2.4 Analysez les résultats avec la phalloïdine.

EXERCICE 3 :

On souhaite connaitre la fonction de Ikkβ dans des fibroblastes embryonnaires de souris. A) Des cellules de type sauvage (Wt) ou porteuses à l’état homozygote d’une mutation perte-de-fonction Ikkβ-/- ont été ensemencées et cultivées à la même densité. Les cellules ont été incubées avec phalloïdine-FITC et observées en microscopie confocale (on a deux grossissements différents pour chaque type de cellules). B) Test de la chambre de Boyden. Les chambres supérieures ont été remplies de 20 000 cellules dans 250 µl de DMEM (milieu de base) sans sérum (photo de gauche) et les chambres inférieures ont été remplies de 1% de serum dans 250 microlitres de DMEM. Les cellules sur la face inférieure de l’insert et les cellules à la surface des chambres inférieures ont été colorées au cristal violet et photographiées (photos du milieu et à droite) C) Des immunofluorescences sont réalisées avec des anticorps contre FAK total, FAK phosphorylé, taline et la cytokératine 8 dans les cellules de type sauvage et mutantes. D) Des western-blots ont été réalisés à partir d’extraits protéiques des cellules et des anticorps contre les protéines IKKalpha, IKKβ, pFAK, FAK total, Pyk2 (une tyrosine kinase apparentée à FAK), ILK (pour integrin-linked kinase), taline et vinculine ont été utilisés. Les flèches indiquent des bandes spécifiques. L’astérisque indique des bandes non spécifiques. Les données sont représentatives d’au moins trois expériences. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)72063-6/fulltext

*3.1 Décrivez les résultats en A.

*3.2 Quel est le principe du test de la chambre de Boyden ?

**3.3 La membrane entre les deux chambres a été couverte de Matrigel. Quel est ce composé et à quoi sert-il ?

*3.4 Quelle conclusion tirez-vous de cette expérience ?

**3.5 Que nous apprennent les immunofluorescences ?

**3.6 Analysez et interprétez le résultat du western-blot en D et essayez d’expliquer le phénotype cellulaire observé en 3.4

EXERCICE 4 :

On s’intéresse à deux mutants perte-de-fonction du poisson-zèbre dak et pic. A,D,G Coloration au bleu alcian du squelette céphalique (vue ventrale) de poisson de 6 jours de développement. B,C,E,F,H,I Eléments du squelette isolés vus à fort grossissement. Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000136

*4.1 Que colore le bleu alcian ?

*4.2 Analysez le phénotype des mutants.

Immunomarquage avec des anticorps anti-héparan, anti-kératan et anti-chondroïtine sulfate sur des embryons de poisson-zèbre de 24hpf (heures après la fécondation) sauvage et mutants. (A-C) Vue latérales troncales (D-F) Vues latérales caudales (G-I) Vue du cartilage ceratohyal (à 72hpf). Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000136

*4.3 Que nous révèle l’analyse de ces phénotypes ?

On étudie par hybridation in situ l’expression des gène sox9a et collagen2a1a dans les têtes de poisson à 60hpf. Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000136

*4.4 Quel est l’intérêt de faire cette étude ?

*4.5 Quelles conclusions tirez vous de cette expérience et de l’ensemble des résultats de l’exercice ?

EXERCICE 5 :

On fait exprimer dans le mésoderme de la drosophile la E-cadhérine et la β-caténine couplées chacune à un fluorophore. Lorsque les deux fluorophores sont suffisamment proches l’un de l’autre, un phénomène de FRET a lieu. Source : https://elifesciences.org/articles/33381

**5.1 Qu’est-ce que le FRET ?

*5.2 Dans quel type de complexe trouve-t-on la E-cadhérine et la β-caténine ?

**5.3 Quel évènement impliquant le complexe décrit à la question précédente pourrait faire baisser l’efficacité du FRET ?

Au cours de la gastrulation de la drosophile en vue ventrale externe, on observe non pas le FRET mais le temps de vie de la fluorescence du donneur d’énergie dans le FRET qui est inversement proportionnelle à l’efficacité du FRET. Source : https://elifesciences.org/articles/33381

**5.4 Que peut-on déduire de ces observations ?

EXERCICE 6 :

On observe un épithelium unistratifié formé par les cellules folliculaires autour des cellules germinales dans un ovariole de drosophile. (D). Les panneaux supérieurs sont des plans traversant des domaines latéraux qui capturent une partie de la surface apicale en raison de la courbure des tissus, comme illustré en (E). Les panneaux inférieurs sont des coupes transversales. Des immunofluorescences sont réalisés avec des anticorps anti-Dlg (marqueur de domaines latéraux) et anti-aPKC (marqueurs de domaines apicaux, utilisé sur les coupes transversales uniquement). Les drosophiles utilisées sont transgéniques et expriment la protéine fusion Col IV-GFP. On croise ces drosophiles avec des mutants : spastin-OE qui surexprime la spastine qui clive les microtubules, le mutant de la chaîne lourde de la kinésine Khc-733-3 généré par introduction d’un codon STOP précoce par CRISPR-Cas9, le mutant rab10-/- qui n’exprime plus la petite GTPase Rab10. Source : https://www-cell-com.insb.bib.cnrs.fr/current-biology/fulltext/S0960-9822(21)01701-2

*6.1 Où trouve-t-on habituellement la collagène IV ? Quelle est sa particularité parmi les différents collagènes ?

*6.2 Le mutant Khc-733-3 est-il un mutant gain-de-fonction ou perte-de-fonction ?

**6.3 Le mutant Khc-733-3 a été produit grâce à CRISPR-Cas9. décrivez brièvement le principe de cette technique.

*6.4 Analysez et interprétez les résultats en D et F (E sert pour se repérer) pour spastin OE.

*6.5 Faites la même chose pour Khc-733-3.

*6.6 Que se passe-t-il dans les cellules mutantes rab10-/- ?

EXERCICE 7 :

Des cellules COS (mésenchyme de rein) ont été transfectées avec un vecteur permettant d’exprimer EGFP ou la protéine fusion SRGAP2A-EGFP. En plus elles ont été transfectées avec un autre vecteur permettant d’exprimer les protéines fusion SRGPAP2C-mRFP, SRGAP2B-mRFP, SRGPAC2 avec un de ses domaines appelé F-BAR délété de 5 arginines couplé à mRFP (F-BARΔ5R-mRFP) et SRGPAC2 avec son domaine F-BAR délété de 49 acides aminés (la délétion n’affecte pas les 5 arginines) (F-BARΔ49-mRFP). Sur les images, on observe la fluorescence de EGFP. Barre d’échelle = 5 µm. Source : https://europepmc.org/article/PMC/3357949

*7.1 Quel est l’effet de l’expression de SRGAP2A sur les cellules (Figures A et B) ?

*7.2 Quel est l’effet de SRGAP2C et de SRGAP2B sur l’action de SRGAP2A ?

*7.3 Que nous apprennent les expériences sur le domaine F-BAR de SRGPAC2 ?

**7.4 SRGAP2A fait partie des protéines de la famille GAP qui active les petites GTPases. Quelle pourrait être sa cible et comment pourrait-elle fonctionner ?

On réalise une immunoprécipitation à partir d’extraits protéiques de cellules HEK qui expriment les protéines indiquées (HA et GFP servent de tag pour l’immunoprécipitation). Les anticorps utilisés pour l’immunoprécipitation sont indiqués en haut (ms = anticorps de souris; α = anti- ; IgG est un anticorps contrôle). On réalise un western-blot avec le culot de l’immunoprécipitation et les protéines sont révélés avec un anticorps anti-GFP. Input : correspond à l’extrait protéique avant immunoprécipitation. Source : https://europepmc.org/article/PMC/3357949

**7.5 Que nous apprennent les immunoprécipitations ?

EXERCICE 8 :

Dans des fibroblastes provenant de vache de génotype sauvage (WT) et de vache de génotype mutant pour le gène codant C-Nap1, causant une maladie chez les vaches de race montbéliarde provoquant diverses anomalies de développement (Mutant) sont soumis à une immunofluorescence anti-gamma tubuline. On transfecte des fibroblastes mutants avec un vecteur permettant l’expression de la forme sauvage de C-Nap1 couplée avec le tag Myc (myc-C-Nap1). Une immunofluorescence anti-Myc est réalisée (a, panel en bas à droite). L’ADN est coloré au DAPI. (b) Distance entre les deux centrioles et pourcentage des cellules avec le phénotype anormal selon les cas. Source : https://www.nature.com/articles/ncomms7894

*8.1 Quelle structure cellulaire est localisée grâce à l’anticorps anti-gamma tubuline ?

*8.2 Quel est l’effet de la mutation ?

*8.3 A quoi sert l’expérience avec myc-C-Nap1 ?

On réalise un test de cicatrisation avec les fibroblastes sauvages ou mutants. On suit la cicatrisation pendant 20h. Source : https://www.nature.com/articles/ncomms7894

*8.4 Quel effet de la mutation est ici mis en évidence ?

EXERCICE 9 :

On observe au microscope confocal des embryons de drosophile fixés lors des étapes de la cellularisation où un épithélium se forme à la surface de l’embryon (plusieurs étapes : early, mid et late) et traitées en immunofluorescence avec un anticorps reconnaisant Armadillo (Arm) qui est l’orthologue de la β-caténine chez la drosophile. Les images indiquées MIP correspondent à la projection des intensités maximales des images vues en microscopie confocale. Le côté apical est en haut (flèche rouge) et le côté basal est en bas (flèche blanche). L’épithélium s’épaissit au fur et à mesure du développement. Des embryons sont traités avec des ARN interférents inhibant la production des protéines Scrib (B) et Dlg (C). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/22/dev180976/223180/Scribble-and-Discs-large-direct-initial-assembly

*9.1 Où peut-on s’attendre à voir la β-caténine dans un épithélium ?

*9.2 Que constatez vous sur la répartition de la β-caténine chez le sauvage ?

*9.3 Quel est le rôle mis en évidence ici des protéines Scrib et Dlg ?

EXERCICE 10 :

MOR1 est une MAP (Microtubule Associated Protein) exprimée chez Arabidopsis thaliana. mor1-10 est une mutation hypomorphe dans le gène codant cette protéine. On incube pendant 4 jours des racines en croissance en présence de différentes concentrations de propyzamide, une molécule qui destabilise les microtubules. Les parois cellulaires sont visibles en jaune (coloration avec PI). L’axe apico-basal est vertical. Source : https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koac147/6586806

*10.1 Quel est l’effet du propyzamide aux doses utilisées sur les racines sauvages (WT) ?

*10.2 Quelles sont les conséquences de la mutation mor1-10 sur les effets du propyzamide ? Quelles peuvent être les conséquences fonctionnelles pour la plante mutée ?

**10.3 Proposez une ou des hypothèses pour expliquer le phénotype obtenu.

Avec de la tubuline-GFP, on observe les bandes préprophasiques des cellules en division dans la racine des plants sauvages ou mutants mor1-10, sans ou avec incubation avec 5µM de propyzamide. Source : https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koac147/6586806

**10.4 Qu’observez-vous et en quoi cela explique le phénotype observé plus haut ?

EXERCICE 11 :

Cow est une HSPG (héparane sulfate protéoglycane). On réalise des immunofluorescence permettant de localiser la protéine de signalisation secrétée Wingless lorsqu’elle est extracellulaire (marquage bleu) dans des disques imaginaux d’ailes de drosophile sauvage (A’) ou mutantes où la région dorsale du disque (D) exprime un miARN anti-Cow (B’-E’) avec un gène témoin (RFP) (B’), une forme de Cow dont l’expression n’est pas inhibée par le miARN (C’, E’) ou une forme mutée de Cow dont l’expression n’est pas inhibée par le miARN et sans héparanes sulfates appelée mSG1+2 (D’). On réalise une quantification du signal (région ventrale V et dorsale D, la couleur bleu correspond à A’, le rose à B’, le jaune à C’, le vert à D’ et le marron à E’). Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0111573

*11.1 Précisez ce qu’est une héparane sulfate protéoglycane. Faites un schéma de sa structure.

*11.2 Analysez et interprétez les résultats A’, B’ et C’.

**11.3 Comment peut-on faire produire une forme de Cow sans héparanes sulfates ?

*11.4 Analysez et interprétez les résultats concernant la forme de Cow sans héparanes sulfates.

REPONSES :

1.1 Le test de cicatrisation liée à la blessure de tapis cellulaire consiste à arracher les cellules de manière contrôlée sur une trajectoire précise dans une boîte de Pétri et d’observer à intervalles réguliers/filmer la manière dont les cellules avoisinantes de la “blessure” vont coloniser l’espace vide. La principale composante de la cicatrisation de la blessure sera la migration cellulaire mais il peut y avoir aussi une composante liée à la prolifération. 1.2 La séquence RGD est la séquence sur un certain nombre de molécules de la MEC et notamment la fibronectine sur laquelle se fixe les intégrines. Il s’agit de savoir si le comportement des cellules observé ici dépend d’une interaction RGD-intégrine (et donc probablement fibronectine-intégrine). 1.3 Les microvésicules des ES augmentent la rapidité de la cicatrisation suggérant qu’ils stimulent la migration cellulaire. Le mélange de peptides RGD et YIGSR ralentit la cicatrisation provoquée par les microvésicules. On en déduit que les interactions des intégrines des trophoblastes avec la MEC sont probablement augmentées par les microvésicules mais comme c’est un mélange qui est utilisé, impossible de savoir si c’est la laminine, la fibronectine ou les deux qui sont les molécules impliquées dans la MEC.

2.1 Lorsque la lumière traverse un objet complexe les phases de ses ondes peuvent se décaler en fonction de l’indice de réfraction du milieu qu’elles traversent. C’est cette propriété qui est exploitée par le microscope à contraste interférentiel. Cet effet est amplifié par le microscope à contraste interférentiel. Le faisceau lumineux est dédoublé en 2 faisceaux proches l’un de l’autre par divers systèmes optiques variés avant la traversée de l’objet. Un second système optique recompose les 2 faisceaux qui produisent des interférences qui dépendent de l’épaisseur et de la biréfringence des objets observés. 2.2 En condition contrôle, on observe un marquage membranaire important de la E-cadhérine avec une disposition des cellules en couche épithéliale. La N-cadhérine est aussi exprimée mais de manière plus irrégulière. Avec le traitement E2P4, la E-cadhérine est exprimée de manière plus hétérogène et le marquage n’est plus seulement membranaire mais aussi cytoplasmique. L’expression de la N-cadhérine reste membranaire et semble un peu plus généralisé. Avec le traitement SAHA, l’expression de la E-cadhérine est nettement plus faible et plus du tout membranaire mais péri-nucléaire tandis que la N-cadhérine est bien exprimée à la membrane plasmique. Le traitement E2P4 et surtout le traitement SAHA a aboutit à exprimer comme cadhérine dominante à la membrane la N-cadhérine à la place de la E-cadhérine. Un tel changement se retrouve lorsqu’il y a une transition épithélio-mésenchymateuse. 2.3 La phalloïdine marque les microfilaments d’actine. 2.4 La répartition des microfilaments d’actine est essentiellement sous membranaire sans traitement et avec le traitement E2P4. En revanche, il est plus réparti dans le cytoplasme avec le traitement SAHA avec la formation de fibres de stress. Cela accompagne bien l’idée émise avec l’étude des cadhérines que SAHA a un effet plus fort sur les cellules que E2P4 et qu’il active une transition épithélio-mésenchymateuse.

3.1 La phalloïdine couplé à un fluorophore rend visible les microfilaments d’actine. Chez les cellules mutantes, ces microfilaments sont arrangées en fibre de stress ce qui n’est pas le cas chez les cellules sauvages où l’actine forme surtout une masse au centre de la cellule. 3.2 Il s’agit de la création de deux compartiments avec des milieux de composition différente séparés par une membrane poreuse (en général avec des pores d’un diamètre entre 3 et 12 micromètres (à adapter selon les cellules étudiées)). Les cellules sont déposées sur cette membrane et on les incube durant une durée permettant à certaines d’entre elles de traverser la membrane et de se retrouver à sa face inférieure dans le second compartiment. Celui-ci peut par exemple contenir un milieu avec un chémoattractant. 3.3 Le Matrigel est le nom commercial de la matrice de membrane basale solubilisée sécrétée par les cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Le Matrigel ressemble à la membrane basale riche en laminine/collagène IV que l’on trouve dans de nombreux tissus et est utilisé par les biologistes cellulaires comme substrat tridimensionnel pour la culture des cellules ou comme ici pour tester les capacités migratoires des cellules. 3.4 Il y a plus de cellules mutantes qui ont traversé la membrane vers la chambre inférieure que de cellules sauvages alors même que l’attachement des cellules à la membrane dans la chambre supérieure était similaire (photos de gauche). On en déduit que les cellules mutants ont des capacités de migration plus importantes que les cellules sauvages. On en déduit que Ikkbeta est un inhibiteur de la migration. 3.5 Le niveau général de FAK et de pFAK est le même dans les deux types de cellules, mais les cellules mutantes présentent des concentrations de pFAK à la périphérie cellulaire qui évoque des points d’adhésion focaux. L’expression de la taline (une protéine souvent associée en complexe avec les intégrines) est plus faible dans les cellules mutantes et on ne voit pas de différence notable pour la cytokératine 8 (un filament intermédiaire). 3.6 On a bien une disparition de la bande spécifique pour les puits correspondants aux extraits protéiques des cellules Ikkbeta-/-. On ne constate pas d’augmentation compensatrice importante de l’expression d’Ikkalpha. La quantité de FAK total est augmentée donc il est difficile de dire si l’augmentation de pFAK est du à ce qu’il y ait plus de FAK total (solution la plus probable) ou si une proportion plus grande de FAK est phosphorylée. Pyk2 et ILK sont être plus exprimées chez le mutant tandis que taline est moins exprimée (ce qui confirme ce que l’on avait vu en immunofluorescence). La vinculine est stable ou faiblement augmentée dans les cellules mutantes par rapport aux cellules sauvages. Les capacités de migration accrue des cellules mutantes provient sans doute de la présence de plus de FAK sous la forme phosphorylée.

4.1 : Le bleu alcian colore les tissus cartilagineux, plus précisément les GAG qui se trouvent spécifiquement dans la matrice extracellulaire. 4.2 : Le mutant dak-/- possède un tissu cartilagineux bien coloré en bleu (donc présence siffisante de GAG) mais la forme des chondrocytes est altérée. Aucun n’a la forme en parallélépipède qu’ont les chondrocytes du poisson sauvage. Le mutant pic-/- a le même défaut de morphologie cellulaire mais en plus la matrice extracellulaire est très affectée car elle n’est même plus colorée par le bleu alcian, indiquant une diminution importante de sa teneur en GAG. 4.3 : Le mutant dak-/- présente des quantités diminuées des GAG sulfatés qui sont analysés et le mutant pic-/- présente une disparition complète des GAG. cela confirme ce que l’on avait observé en 4.2. Le mutant pic-/- est nettement plus affecté et ces absences de GAG peuvent expliquer l’absence de coloration au bleu alcian. 4.4 : Sox9 code un gène impliqué dans le développement des chondroblastes et le collagène 2a1a est un collagène spécifique de la matrice extracellulaire cartilagineuse qui est exprimé assez tôt. Il s’agit de voir si les défauts observés ne viennent pas d’anomalies au cours du développement du tissu. 4.5 : On n’observe pas de différence entre le sauvage et le mutant pic-/-. Le mutant dak-/- présente des modifications dans la disposition du cartilage en développement marqué. Cela suggère que le mutant dak-/- a des défauts d’origine développementale qui se répercutent sur sa matrice extracellulaire et la forme des cellules alors que le mutant pic-/- a un phénotype qui apparait plus tardivement et qui affecte uniquement la matrice extracellulaire et la différenciation finale des cellules.

5.1 : Cette technique de transfert d’énergie entre molécules fluorescentes permet de voir en microscopie si deux fluorophores se trouvent à moins de 10 nm l’un de l’autre. Pour ce faire, la longueur d’émission d’un fluorophore A doit pouvoir excité un fluorophore B dont on pourra enregistrer l’émission de photons. 5.2 : On trouve ces 2 molécules dans les jonctions adhérentes type zonula adherens des épithéliums avec des interactions homophiliques extracellulaires entre deux cadhérines et un complexe intracellulaire avec la beta-caténine, la p120-caténine, l’alpha-caténine, la vinculine et des microfilaments d’actine. 5.3 : L’efficacité du FRET baisse si la distance augmente entre les deux flurorophores, c’est-à-dire si le domaine intracellulaire de la E-cadhérine où se trouve le premier fluorophore s’éloigne de la béta-caténine. Cela peut arriver si le complexe se défait ou si il y a une tension sur la E-cadhérine qui la tire vers l’extérieur et déforme le complexe. 5.4 On observe un temps de vie de fluorescence homogène dans les différentes cellules au stade 5 et au début du stade 6 où on observe que des cellules au centre de l’image présentent une légère déformation par rapport aux autres. Au stade 6, cette déformation est accentuée, des cellules sont plus étroites dans une dimension. Ces cellules ont un temps de vie de fluorescence nettement plus élevé que leurs voisines ce qui indique qu’il y a sans doute des tensions aux jonctions intercellulaires accompagnant ces déformations qui éloignent les fluorophores de la E-cadhérine et de la beta-caténine.

6.1 : Le collagène IV est retrouvé habituellement dans la lame basale et elle s’assemble en réseau réticulé et non pas en fibres. 6.2 : Il est précisé qu’un codon STOP précoce a été introduit ce qui veut dire que la protéine est tronquée de sa partie C-terminale lors d’une traduction qui est incomplète. Cela entraîne très probablement la perte-de-fonction de la protéine. 6.3 Grâce à un ARN guide spécifique, l’endonucléase Cas9 réalise une cassure double brin dans la séquence codante de Khc et une séquence d’ADN avec des séquences homologues aux régions autour de la cassure et un codon STOP est introduit et est utilisée par la cellule pour réparer la cassure, permettant l’insertion du codon STOP dans le génome. 6.4 : La surexpression de la spastine détruit le réseau de microtubules. Cela a pour conséquence que le collagène de type IV est présent non seulement dans la lame basale mais aussi sur les côtés latéraux des cellules. Dlg, un marqueur des domaines latéraux semble en partie des régions où le collagène IV s’accumule de manière ectopique. La destruction des microtubules aboutit donc à des défauts de polarisation des cellules épithéliales. 6.5 : La mutation perte-de-fonction de la kinésine donne les mêmes résultats que la destruction des microtubules. Cela indique que la destruction des microtubules avec la surexpression de spastine perturbe essentiellement le trafic des vésicules qui dépend de la kinésine. Ces vésicules doivent être mal adréssées et déversent les précurseurs du collagène IV du côté latéral plutôt que du côté basal. 6.6 : On constate que le collagène IV est nettement moins présent dans la lame basale et qu’une partie est adressée vers la partie apicale. Il s’agit d’une perturbation de la polarité cellulaire encore plus grave que dans les cas précédents.

7.1 : Les cellules sont plus étalées et émettent de fins prolongements : des filopodes. Cela indique des modifications dans le réseau de microfilaments d’actine. 7.2 : Les deux protéines inhibent la formation des filopodes que forme SRGAP2A. 7.3 : La délétion des 5 arginines laisse SRGAP2A former des filopodes dans les cellules donc les 5 arginines sont indispensables pour que SRGAP2C inhibe l’action de SRGAP2A sur la formation des filopodes. En revanche, les 49 acides aminés (où ne figurent pas les 5 arginines) ne sont pas importants pour cette fonction de SRGAP2C (elles peuvent être importantes pour une autre fonction). 7.4 : Cdc42 est la petite GTPase qui active la formation des filopodes et on peut émettre l’hypothèse que c’est la cible de SRGAP2A. Pour l’activer, SRGAP2A échange probablement un GDP contre un GTP ce qui active les petites GTAses telles que Cdc42. 7.5 : Quand on immunoprécipite HA (c’est-à-dire SRGAP2C), on peut mettre en évidence dans la fraction obtenue la GFP (et ce n’est pas le cas lorsqu’on a immunoprécipiter avec l’anticorps IgG contrôle). La GFP est fusionnée avec SRGAP2A dans le panel de gauche et SRGAP2C dans le panel de droite, ce qui montre que SRGAP2C forme un complexe avec SRGAP2A ou avec lui-même. On peut imaginer que SRGAP2C inhibe SRGAP2A en formant un complexe avec lui et en l’empêchant l’agir sur la formation des filopodes.

8.1 : La gamma-tubuline permet de repérer le centrosome composé de 2 centrioles. 8.2 : La mutation provoque une augmentation significative de la distance entre les 2 centrioles du centrosome. 8.3 : Il s’agit d’une expérience de sauvetage pour vérifier que le phénotype lié à la mutation est uniquement du à un manque d’expression de C-Nap1. De plus, cela permet d’introduire une forme taguée de la protéine, facilement localisable grâce à un anticorps couramment utilisée (anticorps anti-Myc). On observe que les cellules qui expriment myc-C-Nap1 retrouvent un centrosome normal où les centrioles sont côte à côte. La cellule en bas à droite n’exprimant pas myc-C-Nap1 a toujours ses deux centrioles éloignés. Le sauvetage a bien marché et en plus, on remarque que myc-C-Nap1 est localisé au centrosome et donc agit directement localement. 8.4 : On observe que la cicatrisation de la blessure réalisée sur le tapis cellulaire démarre de manière similaire entre les cellules sauvages et mutantes mais à 15h et à 20h la cicatrisation des cellules mutantes prend du retard sur celle des cellules sauvages. Cela indique un défaut de migration et éventuellement un défaut de prolifération (la cicatrisation est aussi dépendante de ce paramètre).

9.1 : La β-caténine est localisée au niveau des jonctions adhérentes et également on peut en déceler dans le cytoplasme et éventuellement dans le noyau si les cellules épithéliales répondent à un ligand Wnt. 9.2 : Au stade précoce, la β-caténine est localisée aux niveaux apical, basal et aussi au niveau latéral (flèche verte). Cette dernière localisation s’amenuise aux stades plus tardifs. La localisation apicale devient plus intense que la localisation basale. 9.3 : Lorsque l’expression de l’une ou l’autre de ces protéines est inhibée, on observe la β-caténine tout le long du flanc des cellules épithéliales que ce soit du côté apical, latéral ou basal. Elle est un peu plus présente du côté apical mais la polarité apico-basale de sa répartition habituelle est globalement perdue. Scrib et Dlg sont donc nécessaires à cette polarité de répartition et donc probalement à la formation de jonctions adhérentes fonctionnelles.

10.1 : Ce n’est qu’avec 5 µM de propyzamide que des différences apparaissent chez les racines sauvages par rapport aux racines non traitées. Les files de cellules deviennent perturbées avec l’une des files qui s’est divisée en deux et une cellule qui s’est divisée en 3 perpendiculairement à l’axe principal. Cela suggère des défauts dans l’orientation des divisions cellulaires. 10.2 : Chez le mutant mor1-10, on constate des défauts importants de disposition des cellules dès la dose de 3 µM de propyzamide et les défauts sont encore plus importants à 5 µM (notamment en comparaison avec la racine sauvage à la même dose). La mutation provoque une hypersensibilité des racines à l’action de la propyzamide. Cela suggère que les altérations de l’orientation des divisions cellulaires se font plus facilement. 10.3 : MOR1 est une protéine associée aux microtubules qui doit sans doute les protéger de l’action de la propyzamide. Lorsque cette protéine est moins présente, les microtubules sont plus facilement destabilisés entraînant des dysfonctionnements lors des divisions cellulaires (probablement le positionnement de la bande préprophasique qui est essentiel pour la bonne orientation des divisions cellulaires). 10.4 : On observe que les bandes préprophasiques sont anormales (penchées, dédoublées) chez les mutants en présence de propyzamide. Sachant que la bande préprophasique est essentielle pour positionner correctement le plan de clivage cellulaire, on comprend que toute perturbation de la bande entraîne des divisions mal orientées, provoquant une désorganisation des files de cellules dans la racine.

11.1 : Les HSPG sont constituées d’une protéine dite centrale sur laquelle sont accrochées de manière covalente des glycosaminoglycanes (GAG) de type héparane sulfate (longue chaîne d’oses formée par la répétition d’un dimère acide glucuronique ou iduronique et N-acétylglucosamine). Pour le schéma voir sur la page du site sur les MEC. 11.2 : Quand on inhibe l’expression de Cow du côté dorsal on y observe une baisse marquée de la présence de Wingless extracellulaire (marquage moins intense et surtout moins étendu). L’effet sur le côté ventral est présent mais nettement moins marqué suggérant qu’un peu de Cow produit du côté dorsal pouvait diffuser du côté ventral et y jouer un rôle. L’ajout de la forme normale de Cow dont l’expression n’est pas affectée par le microARN correspond à une expérience de sauvetage pour vérifier si le microARN n’a bien ciblé que l’expression de Cow et pas une autre protéine, ce qui est le cas puisqu’on retrouve les niveaux et la distribution normale de Wingless. 11.3 : Les GAG tels que les héparanes sulfates sont accrochées à des sérines spécifiques de la protéine centrale donc il faut produire une forme mutée de la protéine Cow où les sérines sont remplacées par un autre acide aminé. 11.4 : La forme mutée de Cow sans héparanes sulfates n’est pas capable de sauver la distribution de Wingless (alors que son expression n’est pas ciblée par le microARN) alors que la forme de Cow avec les héparanes sulfates avait réussi à sauver cette distribution. Il en résulte que les héparanes sulfates sont nécessaires à Cow pour contrôler la distribution du Wingless extracellulaire dans les tissus.

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