Exercices sur les cycles et les divisions cellulaires

Niveaux de difficulté : * = embryon; ** = têtard; *** = mature

EXERCICE 1

(A) On suit par western-blot quantitatif la quantité de Cycline B1 total (ligne bleu), la quantité de Cdk1 phosphorylé sur la tyrosine 15 (ligne rouge) et on mesure l’activité de Cdk1 par sa capacité à phsophoryler l’histone H1 (ligne verte) du stade zygote au stade 8 cellules d’embryons de xénope. (B) On suit à nouveau dans une nouvelle série de mesures la quantité de Cycline B1, et on mesure la proportion de Cdc25C qui est hyperphosphorylée et la quantité de Cdc25C phosphorylée sur la sérine 287. M = mitose. Source : https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.1001788

*1.1 En quoi ces stades du développement sont-ils particuliers en ce qui concerne les cycles cellulaires ?

*1.2 Analysez et interprétez les variations de la quantité de Cycline B1.

*1.3 Expliquez la base biologique du test de l’activité de Cdk1.

*1.4 Analysez et interprétez les variations de l’activité de Cdk1.

**1.5 Que nous révèle l’analyse des oscillations de la quantité de Cdk1 phosphorylée sur la tyrosine 15 ?

**1.6 Analysez et interprétez les variations de la proportion de Cdc25C hyperphosphorylée.

**1.7 Analysez et interprétez les variations de la quantité de Cdc25C phosphorylé sur la sérine 287.

EXERCICE 2

Les chercheurs de ces travaux souhaitent comprendre le rôle de la cycline B2 (CCNB2) au cours de la meiose dans des ovocytes de souris. On extrait les protéines d’ovocytes avant ovulation issus de femelles adultes Ccnb2+/+, Ccnb2+/- et Ccnb2-/- et (A) on effectue une analyse par western-blot avec des anticorps reconnaissant CCNB2, CDK1 et l’actine. En B, on utilise les extraits pour phosphoryler in vitro la thréonine 320 de la protéine PP1, une cible de CDK1. On réalise un western-blot avec un anticorps reconnaissant la forme phosphorylée pT320-PP1 et un anticorps reconnaissant PP1 sous toutes ses formes. Ne raisonner que avec les puits 20 dans chaque génotype. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/8/dev172734/19880/Cyclin-B2-is-required-for-progression-through

*2.1 A quelle étape de la méiose se trouvent les ovocytes ? Quel est le génotype de ces ovocytes produits par les femelles Ccnb2+/- ?

*2.2 Que cherche-t-on à vérifier avec le western-blot en A ?

*2.3 Que nous apprend l’expérience en B ?

Les ovocytes sont incubés avec du cilostamide qui bloque toute progression de la méiose. On enlève le cilostamide et on observe le temps que mettent les ovocytes à réaliser la GVBD (Germinal Vesicle Break Down) qui correspond à la « dissolution » de la membrane nucléaire et l’activation de la poursuite de la méiose. L’axe des abscisses a pour unité les heures. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/8/dev172734/19880/Cyclin-B2-is-required-for-progression-through

*2.4 Analysez et interprétez les résultats.

D’autres exercices seront ajoutés progressivement.

REPONSES

1.1 : Ce sont des stades où il y a une oscillation entre une phase S et une phase M qui se succèdent très rapidement (surtout à partir du stade 2 cellules). Il n’y a pas de phase G1 et pas de phase G2. Tout se déroule sans transcription. 1.2 : On observe une augmentation de la quantité de cycline B1 puis une baisse avant chaque division. La hausse est nettement plus marquée chez le zygote avant la première division. Il s’agit des variations classiques avec accumulation de la cycline B1 jusqu’à la métaphase puis sa dégradation par la suite lors de la dernière partie de la mitose par le protéasome. Ici, l’augmentation de la quantité de cycline B1 ne peut pas être dûe à de la transcription (il n’y en a pas à ce stade) mais est sans doute dûe à de la traduction. 1.3 : Cdk1 est une kinase et elle phosphoryle l’histone H1 ce qui provoque la forte condensation de la chromatine en prophase de mitose. 1.4 : Les variations de l’activité de Cdk1 suit les variations de la cycline B1 ce qui est attendu puisque l’activité kinase de Cdk1 dépend de son association avec la cycline B1. 1.5 : La phosphorylation sur la tyrosine 15 de Cdk1 aboutit à une inhibition de son activité kinase. On observe un pic de cette phosphorylation à chaque fois un peu avant le pic d’activité de Cdk1 ce qui veut dire que la montée de cette activité est freinée par un mécanisme régulateur. Le relâchement de ce mécanisme aboutit au pic d’activité. 1.6 : Cdc25C est hyperphosphorylée pendant les mitoses. Elle joue un rôle de déphosphorylation de la tyrosine 15 de CDK1 donc on peut imaginer que cette hyperphosphorylation stimule son activité phosophatase et aide à actiber CDK1 lors de la mitose. 1.7 : Les oscillations de la phosphorylation de la sérine 287 sont en opposition de phase avec les hyperphosphorylations mitotiques de Cdc25C. On peut imaginer que la phosphorylation de la sérine 287 inhibe l’activité de Cdc25C et l’empêche d’aller déphosphoryler la tyrosine 15 de CDK1 en dehors de la mitose.

2.1 : Des ovocytes non ovulés chez des souris adultes sont bloqués en prophase I de méiose. La première division de méiose n’a pas encore séparée les chromosomes paternels et maternels, donc les ovocytes des femelles Ccnb2+/- possèdent un allèle sauvage et un allèle muté perte-de-fonction. 2.2 : On vérifie que l’expression de CCNB2 est bien abolie dans les ovocytes issus des femelles Ccnb2-/- et que l’expression est diminuée environ de moitié dans les ovocytes issus des femelles Ccnb2+/-. Le western-blot permet aussi de vérifier que l’expression du partenaire de CCNB2, CDK1 n’est pas affecté par sa diminution ou son absence. 2.3 : On observe qu’en absence de CCNB2, CDK1 est nettement moins capable de phosphoryler PP1 (moins de la forme phosphorylée avec autant de PP1 total). On en déduit que CCNB2 est nécessaire à la bonne activité kinase de CDK1 (au moins lorsque sa cible est PP1). 2.4 : Lorsqu’il y a une diminution de la quantité de CCNB2 (et encore plus lorsqu’il n’y en a plus), la reprise de la méiose prend plus de temps. Notons tout de même qu’elle a lieu donc CCNB2 n’est pas entièrement nécessaire mais permet d’accélerer le processus. On peut imaginer que d’autres cyclines B et notamment cycline B1 (CCNB1) peuvent finir par compenser l’absence de CCNB2.

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