Exercices sur le contrôle de l’expression des gènes

Par Patrick Pla, Université Paris-Saclay

Niveaux de difficulté : * = embryon; ** = têtard; *** = mature

EXERCICE 1

(a) Embryons de souris Dnmt1-/- et Dnmt3a-/-; Dnmt3b-/- disséqués à E8.5 comparés aux témoins hétérozygotes de la même portée (qui sont identiques à des embryons WT). Barres d’échelle: 300 μm. (b) Distribution moyenne de la méthylation des CpG sur plusieurs centaines de gènes et les séquences flanquantes de 10 kb. TSS = Site de début de transcription; TTS = site de terminaison de transcription. Ces profils de méthylation ont été obtenus après traitement au bisulfite et séquençage. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-020-16919-w

**1.1 : D’après vos connaissances, quels sont les rôles respectifs de Dnmt1 et Dnmt3a/3b ?

*1.2 : Décrivez le phénotype des embryons en a). Trouvez des interprétations pour ces résultats.

**1.3 : Qu’est-ce que le bisulfite ? Expliquez le principe de la détection des séquences méthylées sur les cytosines.

*1.4 : Analysez et interprétez les profils de méthylation.

EXERCICE 2

a) Stades de développement du poisson-zèbre utilisés pour l’analyse de la chromatine. b) Images représentatives montrant le marquage par immunofluorescence avec des anticorps reconnaissant H3K9me3 dans les cellules d’embryons fixés à 2,7, 3,7, 4,5 et 6 h après la fécondation (hpf). Un marquage a été fait avec le DAPI (bleu). Toutes les images ont été prises dans des conditions identiques, la barre d’échelle représente 1 µm. c) Analyse par western-blot pour H3K9me3, histone H3 et alpha-tubuline. d) Enrichissement en H3K9me3 mesuré par immunoprécipitation de la chromatine avec séquençage (ChIP-seq) à 2,5, 4,5 et 6 hpf. Ici, une région génomique représentative est présentée. Ne pas tenir compte de la mention LTR et des bandes roses. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-019-09582-3

*2.1 : Que veut dire précisément H3K9me3 ?

*2.2 : Analysez les immunofluorescences et interprétez.

*2.3 : Quelles informations supplémentaires nous apporte le western-blot ?

**2.4 : Expliquez le principe du ChIPseq. Analysez les résultats présentés en d.

EXERCICE 3

Séquences cibles de 3 facteurs de transcription : Sox3, Pitx1 et Sox10. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26234-7

*3.1 : Expliquez comment analyser ces schémas.

*3.2 : Vous cherchez dans le génome des séquences de fixation pour Pitx1 et vous trouvez la séquence TAATCCTG. Qu’en déduisez vous sur la fixation de Pitx1 sur ce site ?

*3.3 : Que remarquez-vous en comparant les sites consensus de Sox3 et de Sox10 ? Interprétez.

EXERCICE 4

(A, en haut) Carte du gène FoxF (rouge) et de la région 5′ en amont sur le bras chromosomique 3q de l’ascidie Ciona intestinalis. (A, milieu) Diagramme construit avec VISTAplot montrant la conservation des séquences (50-100%) entre deux espèces d’ascidies, Ciona intestinalis et Ciona savignyi (http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml). (A, en bas) Diagramme récapitulatif de l’efficacité de différents fragments à faire exprimer un gène rapporteur LacZ dans la cellule ventrale du tronc (TVC, la cellule précurseur du cœur) ou dans l’épiderme (B) Embryon exprimant LacZ sous le contrôle de la séquence -3052 à +1 du promoteur de FoxF. La flèche indique TVC. (C) Les séquences régulatrices -1135 à -840 de C. intestinalis et de C. savignyi de FoxF sont comparées. Les cases indiquent la boîte E (rouge) et les trois sites de liaison Ets1/2 (vert). (D) L’expression de LacZ est mise sous le contrôle du fragment d’ADN génomique -1135 à -840 pb. (E) On réalise diverses délétions dans l’ADN génomique -1135/-840. Les carrés colorés correspondent aux éléments de régulation trouvés en C. L’histogramme affiche les proportions d’embryons présentant une coloration bleue dans les TVC (n = embryons totaux). (F, G) La région de régulation -3052 à +1 avec le motif E-box délété (ΔE-box) de même que le fragment -1135 à -840 (ΔE-box) contrôle l’expression de LacZ. (H, I) On fait exprimer dans les embryons Ets:VP16 qui est formé par le domaine de fixation à l’ADN de Ets avec le domaine fortement activateur de la transcription de VP16. Il n’y a pas d’expression dans TVC mais dans des cellules appelées B7.5. Un témoin avec le vecteur pCESA est réalisé (LacZ est juste sous le contrôle d’un promoteur minimal). Ne pas tenir compte des figures I et H. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/134/18/3297/64471/FoxF-is-essential-for-FGF-induced-migration-of

*4.1 Quel est l’intérêt de comparer les séquences des deux ascidies ?

*4.2 Que remarquez-vous sur la position des séquences les plus conservées chez les deux ascidies ? Interprétez.

*4.3 Comment révèle-t-on la localisation de l’expression du gène LacZ pour obtenir une image comme en B ?

*4.4 Quel est l’intérêt d’avoir trouvé et indiqué des sites de fixation de facteurs de transcription sur la comparaison de séquence en C ?

*4.5 Que nous révèle la figure D en comparaison avec la figure B ?

*4.6 Analysez et interprétez les résultats en E.

**4.7 Quel est l’intérêt d’étudier la construction -3052/+1 avec la boîte E délétée (F) ?

EXERCICE 5

On traite des embryons de poule en gastrulation avec SU5402 (ou son solvant = contrôle). SU5402 est un inhibiteur des récepteurs aux FGF. On extrait ensuite les ARN et on réalise des RT-qPCR avec des amorces permettant de distinguer pour chaque miARN cité en bas du graphique son transcrit primaire (pri-miARN, barre noire), sa forme intermédiaire (pré-miARN, barre grise) et sa forme mature (miARN, barre blanche). Le graphique présente le rapport entre les quantités d’ARN étudiés avec le traitement SU5402 sur ceux avec le traitement contrôle. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)62316-X/fulltext

*5.1 Quel est l’ARN polymérase qui synthétise les pri-miARN ?

**5.2 Quels sont les complexes qui permettent de produire les pré-miARN et les ARN matures ? Où ces maturations ont-elles lieu dans la cellule ?

**5.3 Comment faire pour distinguer lors de la PCR suivant la RT les pri-, pré-miARN et les miARN matures ?

*5.4 Analysez et interprétez les résultats de l’expérience.

EXERCICE 6

Embryons de souris de E10,5 en vue latérale (B-G) ou en coupe transversale (H-M). C, I : Embryon hétérozygote où un des allèles de Patched1 (Ptch) a une insertion de la séquence LacZ. D, J : Embryon transgénique exprimant LacZ sous le contrôle d’une séquence régulatrice putative (Peak2) trouvée par ChIPseq avec un anticorps anti-Gli1. E, K : hybridation in situ avec une sonde reconnaissant l’ARNm de Nkx2-2. F, L : Embryon transgénique exprimant LacZ sous le contrôle d’une séquence régulatrice putative de Nkx2-2. G, M : on refait une souris transgénique mais cette fois-ci avec la séquence régulatrice mutée sur un site de fixation de Gli1. Barres d’échelle : 1 mm en A-G, 200 µm en H-M. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/134/10/1977/52766/Genomic-characterization-of-Gli-activator-targets

*6.1 Quel est l’intérêt d’étudier un embryon tel que PtchLacZ/+ ?

*6.2 Analysez le résultat de la coloration Xgal en C et I. Quelle est la signification de ce qui est observé par rapport à la fonction de Patched ?

**6.3 Des expériences de ChiPseq ont mis en évidence une séquence Peak2 dans le promoteur de Ptch. Rappelez quel est le principe de cette technique.

*6.4 Analysez et interprétez les résultats obtenus en D, J.

*6.5 Analysez et interprétez les résultats obtenus en F, L.

*6.6 Quelles informations supplémentaires nous apportent les résultats en G, M ?

EXERCICE 7

Le gène Tmen146 codant une sous-unité delta de CatSper exprimé à la membrane plasmique des spermatozoïdes code deux formes de cette sous-unité, une forme courte (Tmen146-s) et une forme longue (Tmen146-l). (d) Structure des transcrits avec les exons (partie épaisse) et les introns (ligne) qui sont épissés. La flèche représente le site de démarrage de la traduction (AUG). (e) On fait exprimer dans des cellules en culture l’un ou l’autre des deux ADNc issus des 2 ARNm obtenus à partir du gène Tmen146. On purifie ensuite les protéines et on les analyse en western-blot avec un anticorps qui reconnait la partie C-terminale de la sous unité delta de CatSper. (f) On réalise une hybridation in situ sur des coupes de testicules de souris avec deux sondes : l’une qui reconnait les ARNm des 2 formes (antisense 1) et l’une qui reconnait uniquement l’ARNm de la forme longue (antisense 2). (g) Au cours du développement post-natal de la souris, on suit par RT-qPCR l’expression de l’un ou l’autre des ARNm. Source : https://www.nature.com/articles/ncomms1153

*7.1 Quel est le processus mis en évidence ici ? Justifiez.

*7.2 Pourquoi l’une des formes de la sous-unité du canal est plus courte ?

*7.3 Sur le western-blot en e, pourquoi choisit-on un anticorps qui reconnait la partie C-terminale de la protéine ?

**7.4 Comment choisir les sondes en hybridation in situ pour ne localiser que les ARNm de la forme longue ?

*7.5 A quoi servent les témoins avec les sondes sens ?

*7.6 Que déduisez-vous de l’analyse de la figure f ?

**7.7 Comment a été choisi la région à amplifier par qPCR (regardez et commentez les diagrammes au dessus des courbes en g) ?

*7.8 Commentez les résultats de la RT-qPCR en g.

EXERCICE 8

On différencie des cellules ES de souris en présence d’acide rétinoïque. Les cellules ES proviennent de souris sauvages ou de souris CBE+47-KO où on a délété par CRISPR/Cas9 une séquence où se fixe habituellement CTCF pour délimiter un TAD (domaine topologique d’association) de la chromatine. Ce site est en 3′ du complexe HoxA (attention, le côté 3′ est à gauche sur le schéma). On fait une analyse en RNAseq et on présente les résultats pour le complexe HoxA : le nombre de séquences obtenu pour les différents fragments est cartographié sur la séquence génomique. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(21)00185-X/fulltext

**8.1 Qu’est-ce qu’un TAD ?

**8.2 Analysez les résultats et essayez de trouver une hypothèse pour les expliquer.

EXERCICE 9

Le gène ZNF507 code une protéine à doigts de zinc qui a des fonctions différentes dans les cellules souches et dans les cellules différenciées. (c) On cartographie les exons présents (les exons sont les boîtes grises, le trait fin correspond aux introns) dans les différentes isoformes de ZNF507 sur la séquence génomique. (d) On différencie des cellules ES en neurones durant un protocole qui prend 50 jours. Par RT-qPCR, on mesure l’expression relative des différentes isoformes. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-018-06908-5

*9.1 Quel phénomène est ici mis en évidence pour expliquer la production des trois isoformes de ZNF507 ?

**9.2 Par RT-qPCR, on souhaite distinguer l’expression des isoformes A et C de l’expression de l’isoforme B. Comment réaliser cet objectif ?

*9.3 Que constate-t-on sur l’expression des isoformes au cours de la différenciation ?

EXERCICE 10

L’ARNm de nanos1 est produit au cours de l’ovogenèse du xénope mais non traduit, à cause de la présence d’une séquence TCE qui crée une structure secondaire particulière de l’ARNm juste en 3′ de l’AUG d’initiation de la traduction. On injecte des ARNm de nanos1 ou de nanos1ΔTCE (avec une délétion de la séquence TCE). Certaines de ces injections sont accompagnées d’une co-injection avec les ARNm de dnd1, vasa, deadSouth, centroid ou dazl qui codent des protéines capables de se lier à des ARN. Au bout de 18 heures, on extrait les protéines et on réalise un western-blot avec un anticorps anti-Nanos1. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/144/20/3755/48156/Maternal-Dead-end-1-promotes-translation-of-nanos1

*10.1 : Proposez un mécanisme pour expliquer comment la séquence TCE bloque la traduction de l’ARNm de nanos1.

*10.2 : Analysez et interprétez ces résultats. Pourquoi la bande dans le puits nanos1ΔTCE est-elle plus basse que les autres ?

On injecte dans des embryons de xénope des oligonucléotides anti-sens qui empêchent la traduction de Dnd1 (AS-oligo) avec (ligne du bas) ou sans (ligne intermédiaire) une protéine Dnd1 synthétisée in vitro. On fixe ensuite les embryons et on réalise une immunofluorescence reconnaissant Xiwi qui est présent dans le plasme germinal et Nanos1. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/144/20/3755/48156/Maternal-Dead-end-1-promotes-translation-of-nanos1

**10.3 : Analysez et interprétez cette expérience.

REPONSES

1.1 : Dnmt1 catalyse la méthylation de maintien des cytosines (après la réplication, méthylation sur les brins néosynthétisés) alors que Dnmt3a/3b est impliqué dans la méthylation des cytosines de novo. 1.2 : Les embryons présentent des malformations sévères et un retard de croissance. Il est difficile de distinguer des structures et des axes précis (surtout pour l’embryon Dnmt1-/-). Dnmt1 et Dnmt3a/3b méthylent les cytosines des séquences CpG et cela a un effet répresseur localisé sur la transcription. Par conséquent, les embryons mutés doivent avoir de multiples gènes transcrits de manière ectopique ou trop précocement ce qui cause une sévère désorganisation. 1.3 : L’ADN génomique est coupé par une ou plusieurs enzymes de restriction. Les fragments sont ensuite traités avec le bisulfite. En présence de ce composé chimique, les cytosines sont converties en uracile, alors que les cytosines méthylées ne sont pas affectées. L’ensemble des fragments traités est ensuite amplifié par PCR puis séquencé. 1.4 : Les profils de méthylation des hétérozygotes sont à peu près normaux et l’absence de Dmt3b peut être compensée par Dnmt3a et inversement. Notons que la compensation de Dnmt3b par Dnmt3a n’est que partielle. L’absence des deux Dnmt3a/b provoque une baisse drastique de la méthylation et également l’absence de Dnmt1.

2.1 : Cela désigne une triméthylation de la lysine en position 9 dans l’histone H3. 2.2 : On voit une fluorescence apparaître progressivement au fil du développement. Cela veut dire qu’il y a de plus en plus de triméthylation de la lysine 9 de l’histone H3. Cela peut vouloir dire qu’il y a de plus en plus d’histone H3 de manière générale ou cela peut vouloir dire qu’il y a de plus en plus de lysines 9 dans la population des histones H3 qui sont triméthylés (et non plus diméthylés ou simplement méthylés ou pas méthylés du tout). 2.3 : La quantité d’histone H3 ne varie pas (à part une légère baisse à 2.7 hpf et 3.7 hpf) si on la compare au contrôle alpha-tubuline. Cela veut donc dire que la forte augmentation de la présence de triméthylation de la lysine 9 observée à 4,5 hpf et 6 hpf est dûe à l’augmentation de la méthylation de lysine et non à une augmentation générale de la quantité d’histone H3. 2.4 : De l’ADN génomique est traité avec un agent fixateur pour que les protéines restent accrochées dessus. L’ADN est fragmenté par sonication puis incubé avec un anticorps reconnaissant une protéine particulière sur l’ADN. Après précipitation, on purifie l’ADN obtenu dans le culot et on le séquence à haut débit. Ici, sur ce fragment de chromatine, on observe au cours du temps une augmentation générale de l’enrichissement qui signe la présence de la triméthylation de la lysine. Une séquence centrale est particulièrement enrichie, signant une triméthylation particulièrement poussée dans cette région du génome.

3.1 : Ces schémas représentent les séquences consensus de fixation de facteurs de transcription sur leurs séquences cibles dans les promoteurs et les enhancers/silencers. Les séquences consensus d’un facteur de transcription donné ne sont jamais à 100% conservés à travers tout le génome. Lorsqu’à une position donnée, il n’y a qu’une seule grande lettre qui prend toute la hauteur (le T en 4ème position pour Sox3 par exemple) cela veut dire que le nucléotide est toujours présent. Lorsqu’il y a plusieurs lettres l’une sur l’autre à une position, la taille relative des lettres indique la probabilité de trouver cette lettre dans la séquence consensus à cette position. Par exemple, en 1ère position pour Sox3 on trouvera très fréquemment un C, moins fréquemment un G ou un T et très rarement un A. 3.2 : C’est un site putatif ou potentiel qui correspond bien à ce qui est attendu d’une séquence où se fixe Pitx1. Mais en aucun cas, cela prouve que Pitx1 se fixe effectivement à cet endroit. Il faut faire des tests spécifiques de fixation de facteurs de transcription (EMSA, ChIPseq…). 3.3 : On trouve une ressemblance, notamment dans la partie centrale. C’est normal puisque Sox3 et Sox10 font partie d’une même famille multigénique et par conséquent, malgré des divergences, les sites de fixation à l’ADN ont conservé des ressemblances et donc aussi les séquences de l’ADN où ces facteurs de transcription s’accrochent.

4.1 : Si des séquences sont plus conservées que d’autres entre les 2 espèces c’est qu’il y a sans doute eu une sélection et que les mutants dans ces séquences ont été éliminées. Par conséquent, ces séquences doivent avoir une importance fonctionnelle. 4.2 : Les séquences les plus conservées se trouvent en premier lieu dans les exons, ce qui est logique puisque la séquence codant les acides aminés de la protéine se trouve dans les exons (mais la séquence codante ne recouvre pas tous les exons (il y a le 5’UTR et le 3’UTR qui sont dans les exons mais qui ne sont pas traduits)). Ensuite, on trouve des séquences très conservées en amont du site de démarrage de la transcription et aussi dans une partie de l’intron. Ces deux dernières séquences pourraient être des séquences régulatrices de la transcription. 4.3 : Les embryons sont fixés (suffisamment pour éviter la dégradation des tissus, mais pas trop pour ne pas inactiver les enzymes). LacZ code la beta-galactosidase qui est une enzyme. On lui présente ses substrats Xgal et le cyanide ferrique (et pas le galactose qui serait son substrat habituel dans une bactérie !) et l’enzyme catalyse une réaction qui donne un produit coloré en bleu. Une post-fixation est parfois nécessaire pour éviter la disparition de la coloration avec le temps. 4.4 : Les sites putatifs de fixation de facteurs de transcription peuvent donner une idée des facteurs qui pourraient être impliqués dans le contrôle de l’expression de FoxF à partir de ces éléments. Trouver que ces séquences particulières sont conservées entre deux espèces donne du poids au fait que ces séquences sont fonctionnelles et importantes. Mais cela ne constitue pas une preuve de la fixation réelle de ces facteurs de transcription sur ces séquences. 4.5 : On voit que ce fragment d’ADN restreint l’expression de LacZ aux cellules TVC alors que le grand fragment -3052 à +1 conduisait aussi LacZ à être exprimé dans l’épiderme. Donc la séquence qui contrôle l’expression dans l’épiderme se trouve en dehors du fragment -1135 à -840. Il reste possible que d’autres séquences contrôlent l’expression dans les TVC en dehors de ce fragment, même s’il parait suffisant, le niveau d’expression n’est peut-être pas optimal. 4.6 : La délétion de la boîte E aboutit à une perte totale de l’expression du gène rapporteur dans les TVC. Elle est donc nécessaire pour que FoxF y soit exprimé. La délétion des éléments Ets individuellement a des conséquences moins sévères mais significatives et la délétion de deux de ces éléments a des conséquences sévères. Cela indique que la délétion d’un élément Ets peut être partiellement compensée par la présence des autres mais pas la délétion de deux éléments. 4.7 : Il s’agit de vérifier s’il n’y a pas un autre élément régulateur dans le grand fragment qui pourrait compenser la perte de la boîte E. Il n’y en a pas. On constate aussi que l’expression dans l’épiderme semble plus forte que dans le contrôle sans la délétion ce qui suggère que la boîte E contenant des éléments de régulation inhibiteurs de l’expression dans l’épiderme.

5.1 : L’ARN polymérase II. 5.2 : Les pré-miARN sont produits par le complexe Drosha dans le noyau et les miARN mature sont produits par Dicer puis RISC dans le cytoplasme. 5.3 : Pour les pri-miARN, il faut choisir au moins une des deux amorces de telle manière à ce qu’elle reconnaisse des séquences qui ne sont présentes que dans le pri-miARN et non pas dans les formes plus matures car elles auront été excisées. Pareil pour les amorces pour les pré-miARN. Pour le miARN, les séquences seront trouvées dans les précurseurs donc on ne peut pas trouver d’amorces spécifiques mais on peut soustraire le signal obtenu par les précurseurs du signal obtenu avec les amorces des miARN. 5.4 : Globalement l’inhibition de la signalisation FGF aboutit à une augmentation des miARN matures. Cela provient en partie d’une stimulation de la transcription des gènes codant ces miARN car on observe une augmentation de la quantité de pri-miARN. Dans certains cas, la baisse de la quantité de pré-miARN indique une stimulation de leur maturation en miARN matures (miR-9 et miR-218 et dans une moindre mesure miR-let7b). Pour d’autres cas, c’est l’étape de maturation des pri- en pré-miARN qui est stimulée (miR-130b). On en conclut que FGF inhibe la production et la maturation des précurseurs des miARN à différents niveaux.

6.1 : Le gène rapporteur LacZ est inséré dans le locus d’un gène d’intérêt et donc sa transcription est soumise aux mêmes séquences régulatrices que ce gène. Cette insertion peut provoquer une perte-de-fonction mais seul un des deux allèles est ainsi muté et en général, l’allèle sauvage restant est capable de compenser et le phénotype de l’embryon est normal ou très peu altéré. Dans ce cas précis, Ptch code le récepteur de Shh donc on peut savoir où ce récepteur est exprimé. 6.2 : LacZ est exprimé le long de l’embryon dans un bon tiers ventral du tube neural avec un gradient (diminution an allant vers la région dorsale). Il est exprimé dans la corde et un peu dans le mésenchyme latéral adjacent, sans doute le sclérotome qui va former les vertèbres. Comme LacZ est sous le contrôle des séquences régulatrices de Patched, on peut en déduire que le récepteur de Shh est probablement exprimé dans les mêmes régions et cela donne une idée où le morphogène Shh peut agir (il est produit par la corde et la plaque du plancher (la partie la plus ventrale du tube neural)). 6.3 : voir cette page . 6.4 : Le gène rapporteur est exprimé dans une partie seulement du domaine d’expression de Ptch qui a été observé en C, I. Il manque notamment l’expression dans le sclérotome et dans la partie la plus dorsale du domaine d’expression dans le tube neural. D’autres éléments régulateurs que Peak2 doivent intervenir pour contrôler la transcription de Ptch. 6.5 : On observe une expression irrégulière du gène rapporteur dans la partie ventrale du tube neural, d’un côté en grande majorité (à droite sur l’image, gauche ou droite pour l’embryon on ne peut pas le savoir). Quand on compare avec l’hybridation in situ en E, K, on constate que la séquence régulatrice utilisée ne permet pas de bien récapituler l’expression du gène Nkx2-2. Il y a même une expression ectopique (soulignée par les flèches) hors du domaine habituel d’expression de Nkx2-2 ce qui indique que d’autres séquences régulatrices de ce gène doivent être répressives. 6.6 L’expression du gène rapporteur disparait presque complètement ce qui nous indique que les séquences régulatrices mutées sont importantes et que Gli1 est très probablement impliqué. Une petite partie de l’expression ectopique est maintenue (flèche) ce qui indique que le contrôle de cette partie du patron d’expression n’est pas réalisé par Gli1 mais par un autre facteur de transcription qui peut toujours se fixer sur la séquence régulatrice malgré la mutation introduite.

7.1 : On observe que les transcrits finaux n’ont pas la même composition en exons avec l’exon 1 et l’exon 5 manquant dans l’un des cas. Comme le montre le western-blot en e, cela donne des protéines de taille différente. On en déduit qu’il s’agit d’un cas d’épissage alternatif. 7.2 : Le site de démarrage de la traduction de la forme longue est dans l’exon 1. Or celui-ci est épissé dans l’ARNm de la forme courte et ce n’est que dans l’exon 7 que se trouve l’AUG de démarrage de la traduction. La protéine est donc plus courte car il lui manque les acides aminés codés par les exons 1 à 6. 7.3 : La partie N-terminale de la protéine est différente chez la forme longue et courte et donc il faut prendre un anticorps qui reconnait une partie commune entre les deux formes de la protéine et c’est le cas de la partie N-terminale. 7.4 : On doit choisir des séquences d’ARNm anti-sens qui s’hybrident avec des séquences spécifiques de la forme longue. La forme longue peut être reconnue par une sonde qui s’hybride avec les séquences correspondantes à l’exon 1 ou à l’exon 5. 7.5 : Les hybridations avec les sondes sens servent de témoin négatif : elles permettent d’estimer le marquage de bruit de fond lié à la procédure. 7.6 : Avec la sonde antisense 1, on voit que l’une ou l’autre des formes est exprimée dans toute la paroi des tubes séminifères alors que la sonde antisens 2 qui ne reconnait que la forme longue donne un signal que dans des cellules du côté basal des tubes séminifères dans la région où se trouvent les spermatogonies. On peut penser que la forme longue est d’abord exprimée dans les spermatogonies et qu’ensuite c’est uniquement la forme courte qui est exprimée dans des cellules germinales plus matures. Notez que la forme courte peut aussi être exprimée dans les spermatogonies (on n’a aucun moyen de le prouver ou de l’infirmer avec les données présentées). 7.7 : Le fragment à amplifier spécifique de la forme longue correspond à l’exon 5. Le fragment à amplifier pour la forme courte est à cheval entre l’exon 4 et l’exon 6. Les oligonucléotides utilisés pour amplifier ce deuxième fragment peuvent reconnaitre des séquences correspondantes aux formes longues mais le transcrit sera de taille plus importante dans ce cas, ce qui permettra de distinguer les transcrits. 7.8 : La forme courte est exprimée plus précocément que la forme longue et est exprimée plus fortement même lorsque la forme longue est également produite à partir des jours 17-20 après la naissance. A 80 jours après la naissance, les quantités relatives s’égalisent cependant par baisse de la quantité d’ARNm de la forme courte.

8.1 : C’est une région de la chromatine (flanquée par des isolateurs où se fixent CTCF) où les interactions entre séquences régulatrices de la transcription sont privilégiées. 8.2 : On constate que le nombre de séquences lues en RNAseq et donc le niveau de transcription est globalement augmenté pour tous les gènes du complexe entre Hoxa1 et Hoxa9. La transcription des gènes plus en 5′ dans le complexe reste éteinte. La frontière de TAD qui a été otée chez le mutant est en 3′ du complexe donc du côté des gènes dont la transcription a été stimulée. On peut penser que leur transcription chez le mutant est tombée sous l’influence d’un enhancer qui se trouve habituellement dans un autre TAD et qui n’agit pas sur eux dans les cellules sauvages.

9.1 : On observe que certains exons sont présents dans des isoformes et pas dans d’autres (par exemple, le 6ème exon est présent dans les isoformes B et C mais pas dans l’isoforme A). On en déduit qu’il s’agit d’un épissage alternatif. 9.2 : Les isoformes A et C ont l’exon 9 en commun mais il n’est pas présent dans l’isoforme B. Il suffit donc de choisir des amorces pour la qPCR qui soient dans l’exon 9. Pour suivre l’expression de l’isoforme B qui n’a pas d’exon 9, on peut choisir des amorces dans les exons 8 et 10, la taille du fragment obtenu sera plus courte pour l’isoforme B que pour les isoformes A et C (où l’exon 9 rallonge la séquence entre les deux amorces). 9.3 : L’expression des isoformes A et C sont quasi-exclusives dans les cellules ES non différenciées mais elle diminue au cours de la différenciation neuronale. Dès le 11ème jour, l’épissage alternatif qui aboutit à l’expression de l’isoforme B est activé et représente la moitié des transcrits. La proportion de transcrits de l’isoforme B augmente ensuite jusqu’à atteindre plus de 90% en fin de protocole. On comprend que ZNF507 a des fonctions différentes dans les cellules souches et dans les cellules différenciées : ce n’est plus tout à fait la même protéine.

10.1 : La structure secondaire de l’ARNm de nanos1 provoquée par la séquence TCE juste en arrière du codon d’initiation pourrait empêcher la progression des ribosomes. 10.2 : En absence de TCE, l’ARNm de nanos1 est bien traduit en protéine mais celle-ci est plus courte que la protéine normale car il manque la séquence correspondante au TCE (qui est en 3′ de l’AUG d’initiation donc dans la séquence codante traduite). En présence de dnd1, vasa et deadSouth, on détecte la protéine Nanos1 montrant que ces protéines sont nécessaires pour permettre la traduction des ARNm de nanos1 qui possèdent leur TCE. Il y a un très léger effet aussi en présence de centroid. 10.3 : Dans les embryons contrôle, on observe une co-localisation entre Xiwi et Nanos1 indiquant que Nanos1 est localisée dans le plasme germinal. En absence de Dnd1, le plasme germinal est toujours présent (mais différemment localisé) comme l’atteste l’expression de Xiwi mais on ne détecte plus Dnd1. Le sauvetage de ces embryons par une protéine Dnd1 restaure partiellement la bonne localisation du plasme germinal. On déduit de ces expériences que Dnd1 est nécessaire pour la production de la protéine Nanos1 et que celle-ci est nécessaire à la bonne localisation du plasme germinal.

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