La famille TGFβ et ses voies de signalisation

Par Patrick Pla, Université Paris-Saclay

La famille des ligands de type TGFβ et les voies de signalisation associées jouent un rôle fondamental dans de multiples processus cellulaires au cours du développement embryonnaire. Le rôle d’un seul membre de cette famille est souvent multiple (effets pleïotropiques) selon le principe général que les voies de signalisation sont souvent réutilisés de multiples fois au cours du développement dans des localisations différentes. Il faut les considérer comme des modules dont les entrées et les sorties dépendent largement du contexte.

TGFβ

La signalisation TGF-β passe par deux types de récepteurs transmembranaires à sérine-thréonine kinase. La liaison du ligand au récepteur TGF-β de type II (TβRII) stabilise la formation d’un complexe avec le récepteur TGF-β de type I (TβRI) et induit l’activation du récepteur TβRI par la kinase du récepteur TβRII. Les SMADs agissent alors comme effecteurs de signalisation. La phosphorylation C-terminale de Smad2 ou SMAD3 par TβRI entraîne un changement de conformation qui favorise l’hétéromérisation avec SMAD4 et stimule la translocation nucléaire des complexes SMAD. Dans le noyau, les protéines SMAD régulent la transcription en se liant à l’ADN et en interagissant avec d’autres facteurs de transcription.

Cette interaction avec d’autres facteurs est nécessaire car les complexes SMAD ont une faible affinité pour l’ADN. pSMAD3 se lient directement à l’ADN avec SMAD4 au niveau d’éléments spécifiques de liaison à SMAD. Les complexes pSMAD2-SMAD4, en revanche, ne se lient pas directement à l’ADN mais sont recrutés par d’autres facteurs de transcription, le premier caractérisé étant le facteur de transcription forkhead, FOXH1 (anciennement appelé Fast1) (Chen et al., 1996).

Le TGF-β régule la différenciation mésenchymateuse, inhibant la différenciation des ostéoblastes, des myoblastes et des adipocytes.

*TGF-β inhibe la différenciation des myoblastes C2C12. (a,b) Les cellules C2C12 ont été induits à se différencier en milieu témoin (a) ou en milieu supplémenté en TGF-β (b). Les myotubes ont été colorés en immunofluorescence pour la chaîne lourde de myosine (CMH) (vert). Les noyaux ont été colorés au DAPI (bleu). La barre d’échelle indique 100 µm. (c,d) Indice de fusion, défini comme le nombre de myotubes avec ≥ 2 noyaux/nombre total de noyaux et l’indice de différenciation défini comme le nombre de noyaux dans les myotubes MHC+. Le nombre total de noyaux a été réduit par le traitement au TGF-β. (e,f,g,h,i) Dans les myoblastes et les myotubes, les niveaux de phosphorylation de SMAD2 (f,g) et de SMAD3 (h,i) vus par western-blot ont augmenté après 1 h de traitement au TGF-β. LY364947 est un inhibiteur du récepteur de TGF-β. Pan-actine sert de contrôle de chargement. Les niveaux de phosphorylation sont affichés sous forme d’intensité relative de pSMAD/SMAD total. Source : https://www.mdpi.com/2073-4409/9/2/375/pdf

C’est SMAD3, et non SMAD2, qui médie cette inhibition par le TGF-β de la différenciation des ostéoblastes et des myoblastes. Dans ce dernier cas, Smad3 interagit physiquement avec MyoD et perturbe sa liaison à l’ADN, réduisant ainsi l’expression génique spécifique au muscle. Dans l’inhibition de la différenciation ostéoblastique médiée par le TGF-β, SMAD3 réprime la fonction de CBFA1 sans perturber sa liaison à l’ADN.
C’est encore SMAD3 qui inhibe la différenciation adipocytaire en aval de TGF-β. L’adipogenèse, activée par C/EBPβ ou C/EBPδ, est inhibée par TGF-β sans diminution des niveaux de protéine C/EBP. Les C/EBP interagissent physiquement à la fois avec SMAD3 et SMAD4, et cette interaction est corrélée à la répression de la transcription médiée par C/EBP au niveau des promoteurs des gènes codant des protéines essentielles pour la différenciation adipocytaire, avec des sites de liaison C/EBP multimérisés. Mais l’action de SMAD3 et SMAD4 n’affectent pas la liaison de C/EBP à ces séquences cibles. Ces données représentent le premier exemple d’inhibition directe de la fonction de transactivation d’un facteur de transcription par SMADs (Choy et Derinck, 2003).

D’une manière générale, la signalisation TGFbeta a une fonction pro-matrice extracellulaire (MEC). Elle favorise le dépôt net de la matrice en augmentant l’expression de composants spécifiques de la MEC tels que la fibronectine et le collagène, en activant l’expression des inhibiteurs des protéases de la MEC tels que l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène-1 (PAI-1) et les inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases matricielles (TIMPs), tout en diminuant l’expression des protéases qui dégradent les composants de la matrice, comme la collagénase interstitielle.

**L’induction de l’expression de la fibronectine par TGF-β nécessite l’activation de la kinase JNK. (A) L’induction de l’expression de la fibronectine après stimulation par le TGF-β a été testée dans des cellules BAHgpt (une lignée de fibrosarcome humain) transfectées avec un vecteur d’expression vide ou permettant d’exprimer JNKDN (une forme dominante-négative de JNK1), MKK4DN (une forme dominante-négative de MKK4 (MKK4 est un activateur de la voie JNK) et p38DN (une forme dominante-négative de p38) par western-blot. (Il manque un contrôle de dépôt à ce western-blot). Source : https://www.embopress.org/doi/full/10.1093/emboj/18.5.1345

Comme nous le voyons sur la figure ci-dessus, l’activation de l’expression de la fibronectine passe par une voie de signalisation particulière, la voie de signalisation JNK. Une autre voie de signalisation, la voie p38 aboutissant à l’activation de ATF-2 et CREB ne semble pas impliquée (Hocevar et al., 1999).

Dans certains contextes cependant, notamment cancéreux, la signalisation TGF-β peut au contraire stimuler la dégradation de la MEC via l’activation de l’expression des métalloprotéinases, notamment MMP-9. TGF-β agit à ce moment-là non pas par les SMAD mais par l’intermédiaire de TAK1 (pour TGF-β activated kinase) qui agit à son tour sur JNK et p38 comme cela a été démontré dans des cellules tumorales de cancer du sein (Safina et al., 2007).

BMP

Les membres de la famille BMP se distinguent des autres membres de la superfamille TGF-β en ayant sept (plutôt que neuf) cystéines conservées dans la protéine mature. Ils ont été d’abord caractérisés par leur capacité à faire différencier les ostéoblastes en ostéocytes mais leurs fonctions sont très variées. Signalons que malgré son nom, BMP1 est à part dans la famille, et est une protéase.

En général, les BMP agissent en tant qu’homodimères mais des hétérodimères ont aussi été caractérisés (BMP2/7 ou BMP4/7 par exemple) (Hazama et al., 1995; Bi et al., 2013).

**La différenciation des ostéoblastes murins (cellules MC3T3-E1) est stimulée par des hétérodimères BMP2/BMP7
Des pré-ostéoblastes sont soumis pendant 28 jours aux différents traitements puis une coloration rouge alizarine qui met en évidence la matrice extracellulaire osseuse (marqueur d’une différenciation des pré-ostéoblastes en ostéoblastes) est effectuée. ATRA = Acide rétinoïque tout-trans, une molécule impliquée dans la résorption osseuse et l’ostéoporose. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0078198

Les voies de signalisation activées ressemblent à celles de TGF-β mais ce sont les SMAD-1, -5 et -8 qui sont activées et non pas les SMAD-2 et -3. SMAD4 est toujours impliqué.

Les BMP sont fortement impliqués dans la mise en place de l’axe dorso-ventral et antéro-postérieur chez les Vertébrés.

*L’inhibition de l’expression de Bmp2, Bmp4 et Bmp7 par des morpholinos antisens inhibe la phosphorylation endogène de Smad1 et provoquent une dorsalisation et des troncatures postérieures des embryons de xénope. (A) Conception des morpholinos (MO) antisens Bmp4, Bmp7 et Bmp2 qui ciblent le codon de démarrage de la traduction dans les deux pseudoallèles exprimés dans l’espèce subtétraploïde X. laevis. (B) La traduction in vitro en présence d’acides aminés marqués au S³⁵de Bmp4, Bmp7 et Bmp2 est spécifiquement inhibée par les MO respectifs. (C) Les MO pour Bmp2, Bmp4 et Bmp7 (à 12 ng chacun) ont été injectés seuls ou en combinaison dans les 4 blastomères d’un embryon de xénope. (D) La phosphorylation de Smad1 dans les embryons de stade 11 est diminuée par la co-injection de plusieurs MO de Bmp. (E-H) Les embryons injectés par Bmp4 MO (F) sont dorsalisés avec des têtes élargies (comparer avec les embryons de contrôle, E). Les pointes de flèches rouges délimitent le marqueur de la moelle épinière Hoxb9 (> 85 %, n = 60). (G) Le phénotype dorsalisé induit par le MO Bmp4 est sauvé par micro-injection de 100 pg d’ARNm Bmp4 de souris. (H) La microinjection d’ARNm de souris Bmp4 seul (100 pg) donne des embryons ventralisés avec de petites têtes, sans yeux et des structures de moelle épinière réduites (pointes de flèches rouges). (I-L) Les embryons déplétés en Bmp4 (J) se développent en têtards nageurs sans nageoires ventrales et avec des têtes légèrement plus grosses que les embryons témoins (I). Notez la position de l’anus, qui est déplacé (postériorisé) jusqu’au bout de la queue (tête de flèche blanche ; >72 %, n=61). (K) Les têtards déplétés en Bmp7 se développent avec une perte partielle de la nageoire ventrale et un anus postérieur (tête de flèche blanche ;> 79 %, n = 51). (L) La double déplétion de Bmp4 et Bmp7 se traduit par des têtards dépourvus de structures de queue (> 90 %, n = 39). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/132/15/3381/52502/Depletion-of-Bmp2-Bmp4-Bmp7-and-Spemann-organizer

*Phosphorylation différentielle de Smad1/5 selon l’axe dorso-ventral lors de la gastrulation chez le poisson-zèbre. Des embryons de poisson-zèbre sauvage (CTRL) ou muté n’exprimant plus SMAD4 (MZsmad4a) à 40% d’épibolie sont fixés puis traités en immunofluorescence avec des anticorps reconnaissant les formes phosphorylées de SMAD1 et 5 (vert) et avec du DAPI reconnaissant l’ADN (violet). Le côté dorsal est à droite. On constate un gradient d’activité de la voie BMP plus important du côté ventral et une diminution progressive vers le côté dorsal. SMAD4, auquel les formes phosphorylées de Smad1 et 5 s’associent doit être présent. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26486-3

SMAD4 est commun entre la voie des BMP et la voie de Nodal (voir plus loin pour la voie Nodal). Chez le poisson-zèbre, BMP a besoin de SMAD4 en aval pour activer correctement ses gènes cibles alors que Nodal peut quand même activer ses propres gènes cibles via des voies de signalisation de compensation (Guglielmi et al., 2021).

**SMAD4 est nécessaire à l’activation par BMP de ses cibles mais pas pour Nodal. Des embryons de poisson zèbre sauvages et mutants (MZsmad4a) n’exprimant plus SMAD4 ont été soumis à une analyse transcriptomique RNAseq et les gènes ont été classés selon qu’ils sont des cibles de la voie de signalisation BMP ou des cibles de la voie de signalisation Nodal. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26486-3

Les ligands BMP peuvent être piégés dans l’espace intercellulaire et empêchés d’agir sur leurs récepteurs par diverses protéines sécrétées : Chordine, Noggin, Follistatine et Gremlin. Cette inhibition a des fonctions très importantes lors de la mise en place des axes, du contrôle de l’apoptose interdigitale ou lors de la formation du cortex (Ichinose et al., 2021).

*Gremlin est nécessaire à la bonne formation des couches internes du cortex. Le cortex d’embryons de souris à E20,5 est fixé puis observé en coupes en immunofluorescence avec un anticorps reconnaissant les formes phosphorylées de SMAD1/5/8 (activées par BMP) et un anticorps reconnaissant Ctip2, un marqueur des couches internes V/VI du cortex. Les souris sont soit Grem1^flox/flox (mais sans Cre recombinase) soit Grem1^cKO, c’est à dire avec une délétion des 2 allèles codant Gremlin1 par une Cre exprimée dans le cortex. On constate que sans Gremlin1, la voie BMP est anormalement activée dans les couches V/VI du cortex et cela a pour conséquence une épaisseur plus faible de ces couches (vue sur coupe avec coloration de Nissl). Barres d’échelle = 100 µm. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/148/14/dev195883/270850/The-BMP-antagonist-gremlin-1-contributes-to-the

La signalisation BMP peut aussi être modulée à la hausse ou à la baisse par différents acteurs intracellulaires. Smurf1 est une E3 ubiquitine ligase qui active la dégradation des récepteurs aux BMP ainsi que de SMAD1/5 (Murakami et Etlinger, 2019). Le recrutement de Smurf1 peut être facilité par SMAD6 et SMAD7 qui peuvent également se fixer sur les récepteurs BMP activés de type I et bloquer la phosphorylation des SMAD1/5/8 (Yan et al., 2009).

Bambi a, quant à lui, une structure très proche des récepteurs de type I de BMPR, mais a un domaine intracellulaire raccourci, sans aucune activité sérine/thréonine kinase. Il s’agit donc d’un pseudo-récepteur, qui joue un rôle de dominant-négatif en bloquant les interactions entre les récepteurs de type I et de type II (Ornichtchouk et al., 1999). Bambi bloque non seulement la signalisation BMP, mais aussi TGF-β et Nodal. Bambi interagit en plus avec le récepteur aux Wnt, Frizzled et aussi avec son effecteur Dishevelled et il facilite leur interaction, ce qui facilite l’activation de la voie canonique Wnt/β-caténine (Lin et al., 2008). On voit donc que Bambi inhibe la voie de signalisation BMP (et apparenté) pour activer une autre voie de signalisation concurrente, Wnt.

La calcineurine qui est une phosphatase activée par les ions Ca²⁺ est capable de déphosphoryler SMAD1/5 et donc d’inhiber la voie de signalisation BMP. Ce rôle a été démontré en aval des FGF qui activent une voie de signalisation menant à une augmentation de Ca²⁺ cytoplasmique et donc à l’activation de la calcineurine dans le futur tissu neural chez la souris (Cho et al. 2014). Ainsi, les FGF contribuent à l’induction neurale (en plus de Chordine et de Noggin qui capturent les BMP avant qu’ils n’atteignent leurs récepteurs).

FHL3 est, au contraire, une protéine qui facilite la signalisation BMP en stimulant la fixation des complexes SMAD1/5/8-SMAD4 sur les séquences régulatrices de ses gènes-cibles. Le gène codant Wnt8 est ainsi plus fortement activé en aval de la signalisation BMP en présence de FHL3 et cela permet de mieux induire de la bordure neurale dans un premier temps puis de mieux spécifier les cellules de crêtes neurales dans un deuxième temps (Alkobtawi et al., 2021).

**FHL3 renforce la signalisation BMP deux fois lors de la formation des cellules de crêtes neurales. Au stade jeune neurula, FHL3 renforce la signalisation BMP dans le mésoderme paraxial ce qui permet d’augmenter l’expression de Wnt8 qui diffuse vers la bordure neurale sus-jacente et induit l’expression de gènes importants pour la formation des cellules de crêtes neurales. Plus tard, au stade neurula âgée, FHL3 renforce à nouveau la signalisation BMP dans la bordure neurale ce qui permet de produire à nouveau plus de Wnt8 qui par un mécanisme autocrine favorise la spécification des crêtes neurales. Dans les 2 cas, FHL3 interagit directement avec le complexe SMAD1/5/8/SMAD4 et facilite sa fixation sur le promoteur de Wnt8. NB = bordure neurale ; NC = crêtes neurales; NP = plaque neurale.

SMAD1/5/8 peuvent avoir des fonctions indépendantes de SMAD4. Notamment, ils peuvent se fixer sur le complexe Drosha et accélérer la maturation de pri-miARN en microARN. C’est le cas pour le microARN miR-21 qui contrôle la différenciation des cellules musculaires lisses de la paroi des vaisseaux sanguins sous le contrôle des BMP.

**BMP4 active la maturation des précurseurs du miARN miR-21 en provoquant la liaison de SMAD1/5 avec le complexe Drosha (b) Des cellules musculaires lisses ont été transfectées avec des siRNA de contrôle (Control-siRNA) ou des siRNA contre p68 (p68-siARN) p68 est un composant du complexe Drosha qui participe au processus de maturation des pri-miARN en pré-miARN (qui deviennent ensuite des microARN). L’expression de pri-miR-21, pré-miR-21 et miR-21 mature a été examinée après un traitement de 2h avec BMP4. (c) Extraits nucléaires préparés à partir de cellules traitées avec BMP4 (2h) et soumis à une immunoprécipitation avec des anticorps anti-p68, anti-DROSHA, ou IgG non spécifique (contrôle), suivi d’une immunodétection sur western-blot avec anti-SMAD1/5, anti-p68 ou anti-DROSHA. Le signal des anticorps anti-lamine A/C sert de contrôle. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2653422/pdf/nihms-95861.pdf

Nodal

Les ligands de la famille Nodal empruntent en partie les mêmes voies que la signalisation TGFβ. Cependant, les récepteurs, les gènes cibles et les interactants régulateurs sont différents.

**Production, maturation de Nodal et voies de signalisation activées par Nodal. Les niveaux d’expression de Nodal sont affectés par l’activité de la super-famille miR-430. Une fois la protéine traduite, elle doit être traitée dans l’espace extracellulaire par des convertases (Furine et PACE4). L’interaction de Nodal avec les BMP (BMP3, BMP7), Lefty ou avec Cerberus à l’extérieur des cellules affecte sa capacité à se lier aux récepteurs. Nodal se lie aux récepteurs I et II de l’Activine et au co-récepteur Cripto/Criptic qui phosphorylent Smad2 /3 (comme TGFβ). Ces Smads forment un complexe avec Smad4 et entrent dans le noyau et avec l’aide de p53, Mixer ou FoxH1 activent la transcription des gènes (notamment ceux impliqués dans l’induction du mésoderme et de l’endoderme). Ectodermine, PPM1A, XFDR et Tgf1 inhibent la voie en entrant en compétition avec les composants de Smad ou les facteurs de transcription. Notez que Nodal et son répresseur Lefty peuvent tous deux exprimés en réponse à la signalisation Nodal, ce qui provoque des rétroactions positives ou négatives.
Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Nodal_signaling_pathway#/media/File:Nodal_signaling.jpg

La protéine Lefty est un antagoniste de Nodal et elle agit de 2 manières : en se fixant sur Nodal directement et en se fixant au co-récepteur Cripto et en empêchant l’interaction de Nodal avec lui de manière compétitive. Le gène codant Lefty est une cible de la voie de signalisation Nodal ce qui en fait un exemple classique de rétroaction négative. Les souris mutantes Lefty2^-/- et les poissons-zèbres mutants perte-de-fonction pour Antivin (l’orthologue de Lefty) produisent trop de mésoderme et ont une ligne primitive trop étendue en conséquence d’une suractivation de la voie Nodal (Meno et al., 1999).

**Sans rétroaction négative de Lefty, la voie Nodal génère une ligne primitive et un mésoderme hypertrophiés. Coupes transversales de gastrulas de souris sauvages (L, M) ou mutants Lefty2^-/- (I, J). J et M sont des agrandissements des régions indiquées en I et L. ect = ectoderme; mes = mésoderme; ps = ligne primitive et ve = endoderme viscéral. Source : https://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(00)80331-7.pdf

La signalisation Nodal est fortement active dans les cellules souches pluripotentes (ES ou iPS) en culture et est nécessaire au maintien de leurs propriétés. La différenciation de ces cellules s’accompagne souvent d’une baisse de la signalisation Nodal, liée entre autre à l’activation de l’expression de Lefty. Dans les cellules souches pluripotentes, l’expression de Lefty est réprimée par un microARN, miR-302. Si on surexprime ce microARN, l’expression de Lefty est plus faible que normalement et les cellules mettent plus de temps à se différencier. L’expression des gènes de pluripotence Nanog, Oct4 et Sox2 met plus de temps à s’éteindre (Barroso-DelJesus et al., 2011).

La voie de signalisation Nodal est essentielle pour mettre en place l’asymétrie droite-gauche. Elle est activée par un flux de liquide extracellulaire contrôlé par des battements ciliaires vers la gauche au sein de l’organisateur droite-gauche qui se trouve dans le plan de symétrie bilatérale et qui est dérivé du nœud de Hensen. La pression exercée vers la gauche active des mécanosenseurs ciliaires qui contiennent des canaux cationiques Pkd2 nécessaires à la mise en place de la polarité droite-gauche (Pennekamp et al., 2002). S’ensuit une entrée de Ca²⁺ dans le cytoplasme qui active une cascade de transduction aboutissant à l’inhibition de l’inhibiteur de la voie Nodal, Dand5 (aussi appelé Cerl2). Les ARNm de Dand5 sont dégradés plus rapidement sous l’action de la protéine Bicc1 activée par le Ca²⁺ (Nakamura et al., 2012, Maerker et al., 2021). La voie de signalisation Nodal peut ainsi agir et activer la transcription de Pitx2 (Yoshioka et al., 1998).

Bien que présentée ici de manière séparée, les signalisations Nodal et BMP peuvent être inter-dépendantes. Par exemple dans l’embryon de souris, Nodal dérivé de l’épiblaste induit la synthèse de BMP4 dans l’ectoderme extra-embryonnaire qui à son tour favorise l’expression de Nodal dans l’épiblaste (Robertson, 2014).

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