Les voies de signalisation FGF

Par Patrick Pla, Université Paris-Saclay

FGF veut dire facteur de croissance des fibroblastes. Le terme de facteur de croissance est assez limitant, et même si ces facteurs font effectivement croitre les populations de cellules par prolifération, leurs rôles ne se limitent pas à cela. Les facteurs de croissance peuvent aussi jouer un rôle instructeur qui provoque des changements sur la détermination des cellules et non pas seulement un rôle sur leur quantité. Et, comme nous allons le constater, les FGF ont des cibles nettement plus diversifiées que les fibroblastes !

La famille FGF est composée de 22 membres (FGF 1-14 et 16-23). Chacun possède un domaine central conservé de 120 acides aminés. Ces ligands sont organisés en sept groupes basés sur des relations phylogénétiques.

***Familles de ligands FGF chez l’Homme. Source : https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wdev.176

Les FGF se lient avec une faible affinité aux protéoglycanes d’héparane sulfate (HSPG) présents sur la plupart des surfaces cellulaires et des matrices extracellulaires. Cette interaction est nécessaire à leur activité.

Les premiers FGF à avoir été identifiés sont les FGF1 et FGF2, purifiés à partir d’extraits d’adénohypophyse et montrant des propriétés mitogéniques (Armelin, 1973; Gospodarowicz et al., 1974). Il existe deux FGFs chez C. elegans : let-756 (let, lethal) essentiel au développement du nématode, et egl-17 (egl, egg-laying defective) requis pour la migration des myoblastes sexuels
(Burdine et al., 1997). Egl-17 est clairement l’orthologue de la famille FGF11/12/13/14 des Vertébrés (Itoh, 2007). Les relations phylogénétiques de let-756 sont moins définies. Trois homologues ont été identifiés chez D. melanogaster : branchless, orthologue de la plupart des FGF des Vertébrés et qui est impliqué dans la migration cellulaire et la ramification des trachées, et thisbe et pyramus impliqués dans le développement (Stathopoulos et al., 2004; Sutherland et al., 1996). Heartless est le nom de leur récepteur chez la drosophile.

***La signalisation FGF est nécessaire à la migration des cellules mésodermiques lors de la gastrulation de la drosophile (A-F) Embryons de type sauvage traités en immunohistochimie avec un anticorps reconnaissant Twist et montrant les premières cellules mésodermiques qui commencent à migrer (A), puis à un stade ultérieur, une fois la migration terminée (B). Dans les embryons mutants BSC25 (délétion de la région génomique qui inclut les gènes codant les FGF thisbe et pyramus) et les embryons mutants htl qui n’expriment pas Heartless (le récepteur aux FGF), les cellules du mésoderme restent agglutinées (C, E) à un stade où les cellules de type sauvage ont initié la migration (A), mais se propagent finalement et contactent les cellules ectodermiques exprimant Dpp (D, F) presque comme le font les cellules de type sauvage (B). Source : http://genesdev.cshlp.org/content/18/6/687.full

Au cours de l’évolution, des évènements supplémentaires de duplication du génome chez le poisson-zèbre portent le nombre de FGFs à 27 comprenant 21 homologues humains (tous excepté le FGF9), et 6 paralogues (Itoh, 2007).


Les FGFs agissent pour la plupart via leurs récepteurs FGFRs. Selon la combinaison ligand/récepteur, différentes voies de signalisation sont activées et interviennent dans une multitude de processus comme l’angiogenèse, la prolifération et la survie cellulaires, la différenciation ou encore la migration. Chez les mammifères, quatre gènes codant des récepteurs de FGF (FGFR1–4) ont été identifiés mais la diversité est bien plus grande à cause de multiples épissages alternatifs (Ornitz et Itoh, 2015; Brewer et al., 2016). Du fait de cette implication dans des processus fondamentaux, de nombreuses pathologies sont associées à des niveaux protéiques anormaux ou à des mutations des FGFs ou de leurs récepteurs. Ils sont notamment souvent associés à plusieurs types de cancer ou à des défauts de développement (Ornitz and Itoh, 2015).

De nombreux FGF présentent des interactions de haute affinité avec plusieurs FGFR, tandis que certains activent des récepteurs uniques ou des isoformes de récepteurs. La plupart des FGF ont démontré une activité mitogène dans une variété de systèmes. Cependant, quelques-uns, les FGF 11-14, 19 et 21-23, ne présentent pas de fonctions prolifératives. La capacité mitogène d’un FGF est probablement dépendante du ou des FGFR avec lesquels il interagit. Par exemple, le FGF-19 joue un rôle dans la régulation de la synthèse du cholestérol et des acides biliaires grâce à une interaction unique non héparine-dépendante avec le FGFR4. Quant à FGF23, il joue un rôle dans la régulation physiologique du métabolisme du phosphate et de la vitamine D.

Les récepteurs aux FGF sont des récepteurs tyrosine kinase. Les modèles classiques d’activation du récepteur tyrosine kinase impliquent la liaison du ligand, la dimérisation du récepteur, la transactivation du domaine kinase, la phosphorylation des tyrosines intracellulaires. Ces sites phosphorylés permettent l’ancrage et l’activation des effecteurs qui orchestrent l’activation des voies de signalisation en aval (Lemmon et Schlessinger 2010).

*Conséquences de la fixation d’un ligand sur un récepteur tyrosine kinase. La liaison du ligand induit la dimérisation des récepteurs tyrosine kinase, juxtaposant ainsi les domaines kinases intracellulaires dans une orientation/proximité adéquate de sorte que la transphosphorylation des tyrosines (représentées par des symboles Y) dans la boucle d’activation (boucle A), et donc l’activation de la fonction kinase secondaire peut se produire. Cela déclenche à son tour des transphosphorylations secondaires (montrées en turquoise) dans de nouveaux domaines, créant des sites d’amarrage pour le recrutement de substrats intracellulaires distincts (montrés dans un assortiment de formes/couleurs en bas à droite). Source : https://f1000research.com/articles/7-872/v1

Différents seuils de force et de stabilité des dimères peuvent également entrer en jeu, ainsi que la dynamique de signalisation engagée par chaque voie en aval (Vasudevan et al. 2015; Zinkle et Mohammadi 2018; Li et Elowitz 2019). Pour les FGFR, où les voies en aval ont été particulièrement bien étudiées, ERK1/2 et Akt sont les principaux effecteurs (Lanner et Rossant 2010; Brewer et al., 2016), mais la voie STAT peut également être activée ainsi que la voie PLCγ.

*La voie de signalisation FGF et celle d’un autre facteur de croissance (PDGF) aboutissent à la phosphorylation de ERK et de Akt. Des cellules mésenchymateuses embryonnaires de souris sont incubées durant une durée indiquée en minutes (de 0 à 120 minutes) à 50 ng/mL de FGF1 ou à 30 ng/mL de PDGF. Les extraits protéiques sont analysés en western-blot avec un anticorps reconnaissant la forme phosphorylée de ERK ou un anticorps reconnaissant la forme phosphorylée de AKT ainsi qu’un anticorps reconnaissant la β-tubuline (contrôle). L’augmentation de la phosphorylation est quantifiée relativement aux cellules sans traitement. Notez l’aspect transitoire de l’augmentation de la phosphorylation et la dynamique différente entre les effets de FGF et de PDGF. Source : https://elifesciences.org/articles/07186
**Voies de signalisations activées par les FGF et leurs récepteurs. La liaison des FGF canoniques au FGFR avec de l’héparane sulfate (HS) (porté par un HSPG) comme cofacteur induit la formation d’un complexe ternaire FGF-FGFR-HS, qui active le domaine tyrosine kinase intracellulaire du FGFR par phosphorylation de résidus tyrosine spécifiques. Le récepteur activé est couplé à plusieurs voies de signalisation intracellulaires, notamment les voies RAS-MAPK, PI3K-AKT, PLCγ et STAT. La voie RAS-MAPK : Le substrat majeur de la kinase FGFR, FRS2α, qui est constitutivement associé à la région juxtamembranaire de FGFR interagit avec CRKL lié à pY463 et est phosphorylé par la kinase FGFR activée. FRS2α phosphorylé recrute la protéine adaptatrice GRB2, qui recrute ensuite le facteur d’échange SOS. SOS recruté active la GTPase RAS qui se trouve à la membrane et qui active alors la voie MAPK. MAPK active les membres de la famille des facteurs de transcription Ets tels que Etv4 (Pea3) et Etv5 (Erm) et les régulateurs négatifs des voies de signalisation FGF tels que SHP2, CBL, SPRY, SEF et DUSP6. La voie PI3-AKT : Le GRB2 activé recrute également la protéine adaptatrice GAB1, qui active alors l’enzyme PI3K, qui phosphoryle ensuite l’enzyme AKT. AKT a de multiples activités, notamment l’activation du complexe mTOR 1 par l’inhibition de TSC2 et la phosphorylation du facteur de transcription FOXO1 l’amenant à sortir du noyau. La voie PLCγ : La kinase FGFR activée recrute et active l’enzyme PLCγ, qui produit de l’IP3 et du DAG par l’hydrolyse de PIP2. IP3 induit la libération d’ions Ca2+ à partir des réserves intracellulaires et l’activation des voies de signalisation en aval. DAG active l’enzyme PKC et ses voies de signalisation en aval. GRB14 inhibe l’activation du PLCγ. La voie STAT : la kinase FGFR active également STAT1, 3 et 5. Ces voies de signalisation activées régulent principalement l’expression des gènes dans le noyau. SPRY interagit avec GRB2 pour inhiber la voie RAS-MAPK et réguler la voie PI3K-AKT. Les dimères de GRB2 sont amarrés à l’extrémité c-terminale de FGFR2 où ils inhibent SHP2, permettant une activité de kinase de récepteur de faible niveau. Les molécules colorées en rouge fonctionnent généralement pour inhiber la signalisation FGFR. Source : https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wdev.176
*Fonctionnement d’une petite GTPase comme Ras. Les petites GTPases sont actives lorsqu’elles sont liées à du GTP. Elles deviennent inactives lorsqu’elles lysent le GTP et elles le font d’autant plus vite qu’elles sont assistées par des GAP, GTPase Activating Protein (qui agissent donc comme des inhibiteurs). Le GDP est remplacé par un GTP ce qui active à nouveau la petite GTPase et les GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) accélèrent le processus (elles agissent donc comme des activateurs). Dans la signalisation FGF, Sos est une GEF pour Ras et donc active la voie de signalisation. D’après https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2019.00121/full

Les récepteurs FGFR peuvent aussi être endocytés à la suite de l’activation de leur voie de signalisation en aval. Les récepteurs peuvent alors être dégradés ou recyclés à la membrane plasmique. L’endocytose et les mécanismes de trafic intracellulaire ont une influence importante sur la dynamique spatiale et temporelle du signal, qui influence les effets biologiques d’une exposition aux FGF (Sorkin et von Zastrow, 2009). La mutation perte-de-fonction de LIS1 qui code une protéine associée à la dynéine et au trafic vésiculaire aboutit à un phénotype rappelant une déficience en signalisation FGF (comme par exemple des membres tronqués voire absents dûs à l’absence de réponse en provenance de l’AER produisant des FGF au cours de la croissance des bourgeons de membre).

***LIS1 est essentielle à la stabilité des récepteurs aux FGF. Des fibroblastes embryonnaires de souris sauvages ou Lis1-/- sont traités avec du cycloheximide (CHX) qui inhibe la traduction et traitées avec FGF2. A différents moments de ce traitement (jusqu’à 6h), on extrait les protéines et on les étudie par western-blot pour l’expression des récepteurs FGFR1 et FGFR2, de LAMP1, une protéine lysosomale et de LIS1. GAPDH sert de contrôle. On constate que la quantité de FGFR est toujours plus basse dans les cellules mutées que les cellules sauvages en présence du ligand, et qu’il y a une baisse très importante de FGFR2 au cours du temps. Cela indique une dégradation accrue des récepteurs. Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(18)30272-9

Avec d’autres expériences, Liu et al. (2018) ont montré que LIS1 était essentiel pour ramener des FGFR à la membrane plasmique après endocytose activée par le ligand. En son absence, les FGFR sont trop envoyés dans les lysosomes et sont dégradés de manière excessive, rendant moins efficace la réception du signal FGF.

Cependant, une destruction des récepteurs et de leurs ligands est quelque fois souhaitable. Par exemple, lors de la gastrulation du poisson-zèbre, le gradient FGF8 est trop étendu si les récepteurs liés à FGF8 ne sont pas suffisamment dégradés. Les récepteurs liés à leur ligand sont d’abord endocytés dans des vésicules couvertes de clathrine. Une protéine appelée HSC70 est essentielle pour désassembler la clathrine de ces vésicules avant que celles-ci ne fusionnent avec les endosomes. Si il y a une mutation perte-de-fonction du gène codant HSC70 alors il n’y a plus suffisamment de clathrine disponible pour les endocytoses et le gradient de FGF8 s’étend causant des défauts de développement (Rengarajan et al., 2014).

***Envoi de FGF8 et de son récepteur à la dégradation ce qui permet de restreindre la portée du gradient de FGF8. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0086373

Parmi les cibles de ERK activés par la signalisation FGF on peut signaler DNMT3A, une DNA-méthyltransférase qui méthyle l’ADN de novo sur des cytosines (ajout de nouvelles méthylations et non simple entretien) aboutissant à une inhibition de la transcription. La phosphorylation de DNMT3A par ERK empêche la DNA-méthyltransférase d’agir et d’inhiber la transcription.

***DNMT3A est directement phosphorylé par ERK.
(A) Schéma du DNMT3A humain montrant les sites de phosphorylation (S255) et d’amarrage d’ERK (ERK D-domain). (B) Les sites de phosphorylation et d’amarrage d’ERK1/ERK2 sont conservés sur DNMT3A chez les vertébrés (Ec, Equus caballus ; Gg, Gallus gallus ; Hs, Homo sapiens ; Mm, Mus musculus ; Rn, Rattus norvegicus). (C) Test de l’activité kinase ERK2 (en utilisant du γ-32P-ATP) sur des formes sauvages ou mutantes de GST-hDNMT3A (GST est un tag pour mieux reconnaitre et isoler la protéine). Il y a des mutations soit sur le site de phosphorylation S255, soit sur les sites d’amarrage de ERK. (D) Etude par western-blot utilisant des anticorps anti-DNMT3A-phosphoS255 (qui reconnait la forme phosphorylée) ou anti-DNMT3A (qui reconnait toutes les formes) après phosphorylation in vitro par ERK2 de formes sauvages ou mutantes de GST-hDNMT3A. (E) Les bourgeons de membre (isolés à partir d’embryons de poulet au jour 4) ont été séparés en régions proximale (P), moyenne (M) et distale (D). Des quantités égales de protéines de chaque région de bourgeon de membre ont été analysées par western-blot avec des anticorps anti-DNMT3A-phosphoS220 (le site de phosphorylation chez le poulet est décalé par rapport à l’humain) anti-DNMT3A, anti-phosphoERK, anti-ERK ou anti-β-actine. On constate que plus on est proche de la partie distale du bourgeon de membre et de l’AER qui produit FGF, plus ERK et DNMT3A sont phosphorylés. Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(14)00622-6

Dans le bourgeon de membre, les FGF en provenance de la partie distale (AER) inhibent DNMT3A via la phosphorylation par ERK, empêchant d’inhiber la transcription de Sox9 par méthylation de l’ADN. Le maintien de l’expression de Sox9 est crucial dans le mésenchyme pour qu’il puisse encore produire du cartilage durant toute la croissance du bourgeon de membre.

Alors que dans la plupart des types cellulaires, le FGF induit la prolifération et
protège de l’apoptose, dans les chondroblastes, il provoque un arrêt de la croissance et contribue à leur différenciation en chondrocytes. Toutes les protéines Rb deviennent déphosphorylées lors du traitement par FGF et l’activité du complexe cycline E/CDK2 (qui contrôle la progression durant la phase G1) est inhibée (Kalupoeva et Basilico, 2012). L’expression de p21 est augmentée. C’est exactement l’inverse de ce que l’on observe dans la plupart des cellules, ce qui montre bien que l’action des ligands sur leurs cibles est contexte-dépendant et dépend de la compétence des cellules.

Lors de cette fonction inhibitrice de la prolifération des chondroblastes et activatrice de la différenciation en chondrocytes, FGF agit via le récepteur FGFR3. Ce récepteur est constitutivement actif à cause de mutations chez des patients atteints de dysplasie (ou nanisme) thanatophore, qui présentent des os longs et des côtes raccourcis (leur croissance dépend initialement du cartilage). La forme mutée de FGFR3 s’autophosphoryle sur les tyrosines intracellulaires et active la voie STAT en aval de ce récepteur sans qu’il y ait de ligands FGF et aboutit à la différenciation de chondrocytes alors même que le nombre de précurseurs n’est pas suffisant pour aboutir à une taille normale du squelette (Webster et Donoghue, 1996).

**Phosphorylation constitutive sur des tyrosines de la forme mutée de FGFR3 qu’on trouve dans la dysplasie thanatophore. Des fibroblastes de souris (NIH3T3) sont transfectés par des vecteurs permettant l’expression de la forme sauvage de FGFR3 (Gly380) et d’une forme mutée de FGFR3 (Arg380) qu’on a trouvée chez un patient atteint de dysplasie thanatophore. Des cellules ont également été transfectées avec le vecteur d’expression vide (Mock). Les cellules ont été cultivées dans un milieu sans aucune source de FGF. FGFR3 a été immunoprécipité puis les protéines récupérées ont été analysées par western-blot incubées avec un anticorps anti-FGFR3 et un anticorps reconnaissant les tyrosines phosphorylées. Source : https://www.embopress.org/doi/epdf/10.1002/j.1460-2075.1996.tb00384.x
Implication de la signalisation FGF dans le développement précoce de la souris

Dans le blastocyste de souris à E4.5, les populations Nanog+ (épiblaste) et Gata6+ (endoderme primitif) sont ségrégées par la signalisation FGF4 (Yamanaka et al., 2010). En effet, les cellules exprimant le récepteur FGFR1 ainsi que la signalisation autocrine FGF4 s’engagent dans l’épiblaste, tandis que la signalisation paracrine FGF4 via FGFR1 et FGFR2 détermine les cellules de l’endoderme primitif.

*Signalisation paracrine FGF4 de l’épiblaste (EPI) vers l’endoderme primitif (PE). Dans les cellules EPI (à gauche), un niveau plus élevé de NANOG en collaboration avec OCT4 et SOX2 active l’expression de Fgf4 et réprime l’expression de GATA6 ainsi que le niveau de signalisation FGF, comme l’indique le faible niveau d’ERK phosphorylé. Dans les cellules PE (à droite), FGF4 sécrété par les cellules EPI active fortement les récepteurs FGFR1 et FGFR2 et la voie de signalisation en aval (beaucoup de ERK phosphorylé). Cette signalisation FGF plus élevée augmente l’expression de GATA6 et réprime l’expression de NANOG. La signalisation FGF et GATA6 activent en coopération les gènes en aval, tels que Sox17 et Gata4. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/143/7/1063/47817/Lineage-specification-in-the-mouse-preimplantation

Les niveaux d’ERK relativement faibles dans les cellules FGFR1+ déclenchent une rétroaction négative, augmentant l’expression de Nanog et l’identité pluripotente de l’épiblaste. En revanche, la signalisation FGF-ERK dans les cellules FGFR1+/FGFR2+ active des cibles alternatives, telles que DUSP, pour réduire l’expression de Nanog et GATA6 dans le futur endoderme primitif (Kang et al., 2017). La suppression de la signalisation FGF par l’inhibiteur de MEK PD0325901 (PD032) ou l’inhibiteur de FGFR PD173074 induit une conversion en épiblaste et aucune spécification en endoderme primitif n’est alors possible (McLean et al., 2014 ; Bessonnard et al., 2017). Conformément à la réduction de l’activité MEK pour établir la pluripotence naïve dans l’épiblaste, PD032 est un composant essentiel du cocktail pour dériver et maintenir des cellules souches embryonnaires de souris (Nichols et al., 2009).

Comme chez la souris, la masse cellulaire interne (MCI) dans le blastocyste humain à 6 jours après la fécondation in vitro (FIV), a montré une colocalisation GATA6 et NANOG avant l’apparition de l’endoderme primitif et de l’épiblaste au jour 7 après la fécondation (Roode et al., 2012). Cependant, le traitement par inhibiteur de MEK ou FGFR ne modifie pas le nombre de cellules NANOG, OCT4 ou GATA4+, ce qui suggère que la signalisation FGF-MEK n’est pas requise dans les embryons humains pour la spécification (Roode et al., 2012). Par conséquent, bien que la ségrégation de l’ICM en endoderme primitif et en épiblaste soit similaire chez les deux espèces, les voies de signalisation sont différentes. Ces données suggèrent que des mécanismes moléculaires et cellulaires spécifiques induisent l’initiation et le maintien de la pluripotence des épiblastes chez l’homme.

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