Niveaux de difficulté : * = embryon; ** = têtard; *** = mature

EXERCICE 1 : sur la voie BMP

*1.1 : A quoi sert l’injection des ARNm de GAP43-RFP ?

*1.2 : Comment s’appelle un embryon de souris à E4,5 ?

*1.3 : Qu’est-ce qu’un dominant négatif ?

**1.4 : Imaginez quel pourrait être le mode de fonctionnement d’un dominant négatif de Smad 4 ? Et d’un dominant-négatif de Bmpr2 ?

*1.5 : Quel est l’effet des dominants-négatifs sur le nombre de cellules ?

*1.6 : Quel est l’effet des dominants-négatifs sur la destinée des cellules ? Conclure sur la fonction de la voie BMP dans le contexte de l’expérience.

EXERCICE 2 : sur la voie Wnt

*2.1 Que constatez-vous sur la figure A ? Qu’est-ce que cela veut dire en ce qui concerne le contrôle de la transcription ?

*(pour CHIR99021) **(pour IWP2 2.2) Expliquez l’action de CHIR99021 et de IWP2 sur la voie Wnt.

*2.3 Est-ce que les résultats en B pour GSK126 seul et CHIR99021 seul confirment les résultats de la figure A et le phénotype des souris Tie2-Ezh2-KO ?

**2.4 Analysez le résultat avec IWP2. Interprétez.

**2.5 Analysez les résultats avec GSK126+CHIR99021 et GSK126+IWP2.

EXERCICE 3 : sur la voie Shh

**3.1 Quel est l’avantage d’utiliser une forme taguée HA de Sufu ?

*3.2 Interprétez les résultats de l’expérience avec le cycloheximide sans les siRNA.

*3.3 Analysez et interprétez les résultats avec les siRNA ? Pourquoi utilise-t-on deux siRNA différents contre Fblx17 ?

**3.4 D’après la description de l’activité de Fblx17, émettez des hypothèses sur ses relations avec Sufu.

*3.5 Comment appelle-t-on le gène de la luciférase dans ce contexte ? Comment révéler l’activité de ce gène ?

**3.6 Analysez et interprétez les résultats obtenus en B.

EXERCICE 4 : sur la voie BMP

*4.1 Quel est l’intérêt d’utiliser des cellules avec la construction promoteur de Sox1::GFP ?

*4.2 A quoi correspondent les deux pics observés sur les résultats du FACS ?

*4.3 Quels sont les effets de BMP4 et de Noggin sur l’expression de la GFP ? Interprétez.

*4.4 Que se passe-t-il lors du traitement avec FK/CsA ? Puis quand on ajoute Noggin à FK/CsA ?

**4.5 Analysez et interprétez les résultats en B. Est-ce qu’il y a un résultat surprenant dans ce blot ?

*4.6 A quoi sert la présence de TBP et tubuline dans l’analyse western-blot en C ?

**4.7 Analysez l’effet de BMP4 dans la figure C.

**4.8 Analysez l’effet de FK/CsA dans la figure C.

**4.9 Quel est l’intérêt du traitement avec l’acide okadaïque ?

**4.10 Etablissez un modèle (sous forme de schéma par exemple) de l’ensemble des résultats.

EXERCICE 5 : sur la voie Notch

*5.1 A quelle étape du développement sont les embryons sur ces photos ?

*5.2 NICD correspond au domaine intracellulaire C-terminal de Notch. Que cherche-t-on à faire en l’exprimant ?

*5.3 GR veut dire récepteur aux glucorticoïdes. Les protéines avec GR ne peuvent rentrer dans le noyau que si les embryons sont traités avec la dexaméthasone. Quel est l’intérêt d’accoler la séquence de GR à celle de NICD ?

*5.4 Quel est l’intérêt de co-injecter les embryons avec l’ARNm de LacZ ?

*5.5 Quel est l’effet de NICDGR sur la spécification des crêtes neurales ?

*5.6 Quel est le rôle de Su(H) dans la voie de signalisation Notch ?

*5.7 Ici, c’est une forme inductible et constitutivement active de Su(H) qui est exprimée. Est-ce que les résultats obtenus sont cohérents avec ceux obtenus précédemment avec NICD ? Que nous apportent ces résultats ?

*5.8 Dl^Stu et Su(H)DBMGR sont des formes dominante-négative respectivement de Delta et de Su(H) ? Que veut dire l’expression dominant-négatif ? Interprétez les résultats de l’expérience.

EXERCICE 6 : sur la voie Wnt

**6.1 Quel est l’intérêt d’étudier le rapport activité luciférase de luciole/activité luciférase de Renilla avec un système tel que décrit dans la légende de la figure ?

*6.2 Analysez et interprétez les résultats de la figure A. A quel niveau AAK1 agit en relation avec la voie de signalisation considérée ?

*6.3 Quelles informations nous apporte la figure B ?

*6.4 Analysez et interprétez les résultats de la figure C.

*6.5 Quel est l’intérêt de l’expérience de la figure D ? Quelles conclusions tirez-vous de cette expérience ?

**6.6 Conclure sur l’ensemble des résultats A à D et posez des hypothèses sur la fonction d’AAK1.

EXERCICE 7 : sur la voie Wnt et la voie Hedgehog

*7.1 Dans quelle voie de signalisation est impliqué Gli1 ? Quel est son rôle ?

*7.2 Analysez et interprétez les résultats sans vous occuper des expériences avec le siARN sFRP-1.

*7.3 Dans quel compartiment la β-caténine agit-elle lorsque la voie Wnt est activée ? Qu’auriez-vous fait pour le vérifier dans le cadre de ces expériences ?

*7.4 Sachant que sFRP-1 est capable de fixer Wnt dans le milieu et que c’est une protéine extracellulaire, non transmembranaire, quel est l’effet de sFRP-1 sur la voie Wnt en général ?

*7.5 Quelles informations supplémentaires nous apportent les expériences avec le siARN sFRP-1 ? Interprétez.

*7.6 Quelles sont les conclusions à tirer de l’expérience B ?

*7.7 Quelle voie est activée ou inhibée par la cyclopamine ?

*7.8 Quel est l’intérêt d’utiliser les cellules SIIA ? Analysez les résultats en C.

**7.9 Présentez un modèle de l’ensemble des résultats. Proposez des expériences pour tester votre modèle.

EXERCICE 8 : sur la voie FGF

*8.1 Que constatez vous sur les résultats du séquençage d’ADN et que concluez vous ?

*8.2 Que nous apporte les comparaisons de la séquence protéique ?

*8.3 Avec les résultats présentés, que peut-on conclure au sujet de l’effet de la mutation sur la voie de signalisation FGF ?

EXERCICE 9 : sur la voie Wnt

*9.1 Avec vos connaissances, expliquez rapidement pourquoi l’injection de la β-caténine sauvage dans la future région ventrale d’un embryon de xénope induit un double axe.

*9.2 Analysez et interprétez les résultats de l’expérience.

EXERCICE 10 : sur la voie Notch

*10.1 Quel est l’effet testé de CB-103 sur la voie Notch ? Que nous permet de connaître le DAPI ? Cet effet a-t-il lieu ?

*10.2 Quel est l’effet de CB-103 qui est mis en évidence dans cette expérience ?(ne tenir compte pour l’instant que de l’expérience avec une co-expression faible de MAML1)

**10.3 Comment concilier ces observations avec celles de l’expérience I ? Proposez des hypothèses pour expliquer l’effet de CB-103.

**10.4 Que nous apprend l’expérience avec les concentrations croissantes de MAML1 ?

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REPONSES

1.1 : La fluorescence sert à distinguer les cellules descendantes du blastomère injecté et des cellules descendantes du blastomère non injecté et qui servent de contrôle interne à chaque embryon. 1.2 : un blastocyste. 1.3 : c’est une protéine (ou un gène muté codant une protéine) qui non seulement est inactive mais aussi empêche les protéines normales d’agir. 1.4 : Le dominant négatif de Smad4 pourrait se fixer à Smad1/5/8 sans pouvoir activer la transcription. Le dominant-négatif de Bmpr2 pourrait former un hétérodimère avec le récepteur normal sans activer de voie de transduction. 1.5 : il y a une diminution du nombre total de cellules ce qui montre un effet sur la prolifération ou sur la survie des cellules. 1.6 : il y a moins de détermination en TE et PE et plus de détermination en EPI. La voie BMP oriente la détermination des cellules de l’embryon de souris vers le TE et le PE (qui sont les deux lignages extra-embryonnaires, contrairement à EPI).

2.1 : Chez le mutant, il y a plus de β-caténine dans le noyau, ce qui veut dire que ses gènes cibles sont sans doute plus transcrits. 2.2 : CHIR99021 inhibe GSK3β qui ne pourra donc pas phosphoryler β-caténine et donc celle-ci ne sera pas dégradée et pourra entrer dans le noyau et activer la transcription. C’est un activateur de la voie Wnt. IWP2 inhibe la phosphorylation de LRP6 ce qui va l’empêcher d’arrimer Axin et d’inhiber l’activité kinase de GSK3β. C’est un inhibiteur de la voie Wnt. 2.3 : Chez le mutant, il n’y a pas d’activité Ezh2 et il y a moins de précurseurs érythro-myéloïdes produits. Cela se retrouve ici avec GSK126 qui inhibe Ezh2 et diminue le nombre de colonies produites. Chez le mutant, l’activité β-caténine dans le noyau est renforcée, ce que fait aussi CHIR99021 et on obtient également moins de colonies. 2.4 : Il y a moins de colonies formées, or IWP2 est un inhibiteur de la voie Wnt et doit aboutir à une moindre activité nucléaire de β-caténine. Ce résultat est inattendu, cependant on peut imaginer que pas de voie Wnt activée peut avoir le même résultat que trop de voie Wnt activée. 2.5 : Il n’y a pas beaucoup de changement avec le traitement avec GSK126+CHIR99021 par rapport aux molécules seules : dans toutes les situations on activait la voie Wnt et elle ne peut pas sans doute être plus activée. Dans le cas de GSK126+IWP2, on constate une augmentation significative de la formation de colonies par rapport à GSK126 seul : GSK126 active indirectement la voie Wnt mais IWP2 l’inhibe ce qui compense et permet à plus de colonies de se former.

3.1 : Avec la tag HA, on est sûr que l’anticorps anti-HA reconnaîtra notre protéine d’intérêt même si elle change de conformation à la suite de la mutation S532F. Le tag HA peut aussi permettre de pallier l’absence d’anticorps disponible contre une protéine. 3.2 : Alors que le contrôle GAPDH reste au même niveau, on voit la protéine Sufu-HA de moins en moins présente au fur et à mesure du temps. Elle est dégradée (et le cycloheximide assure que pas de nouvelles protéines la remplace). On constate que la dégradation de la forme mutée est plus rapide que celle de la forme sauvage. 3.3 : L’inhibition de l’expression de Fblx17 aboutit à une dégradation plus lente de Sufu mutée. Elle devient même plus lente que celle de la protéine sauvage à gauche. Cela veut dire que Fblx17 est nécessaire pour la dégradation de Sufu (celle normale de la forme sauvage et celle accélérée de la forme mutée). On utilise deux siRNA différents car les siRNA peuvent dans certains cas inhiber la traduction d’autres ARNm que ceux ciblés. Si on a le même phénotype avec deux siRNA, cela indique que les effets sont spécifiques. 3.4 Fblx17 est une E3 ubiquitine ligase et donc participe à l’ubiquitinylation de protéines qui sont ainsi désignées pour la dégradation dans le protéasome. Il est donc probable que Fblx17 fait partie du complexe qui ubiquitinyle Sufu et l’envoie se faire dégrader. 3.5 La luciférase est un gène rapporteur qui code une enzyme qui catalyse une réaction de bioluminescence en présence de son substrat, la luciférine (et d’O₂, d’ATP et de Mg²⁺). On réalise la réaction dans un luminomètre qui détecte les photons produits. 3.6 Dans les conditions normales, l’activation de la voie Shh aboutit bien à l’augmentation de la transcription à partir du promoteur de Gli1. En absence de Sufu, l’activation de la voie Shh ne change rien à l’activité luciférase (qui doit être très élevée; on ne connait pas la valeur absolue de l’activité luciférase mais l’activité relative avec agoniste/sans agoniste). Lorsque Sufu est mutée, l’activation lorsque la voie Shh est activée par rapport à lorsqu’elle n’est pas activée est très importante. La cellule répond trop fort, sans doute car Sufu est mutée est dégradée particulièrement rapidement et qu’elle est une inhibitrice de l’activation du promoteur de Gli1.

4.1 : La GFP est une protéine rapportrice facilement visible sur des cellules vivantes et donc juste en illuminant avec un laser bleu les cellules en cours de traitement, on peut suivre l’induction neurale dans les cellules en temps réel. 4.2 : Le premier pic correspond sans doute au bruit de fond de fluorescence GFP lié au fait que le promoteur de Sox1 est un peu actif (phénomène de fuite). Le deuxième pic à droite correspond en revanche à une activation « physiologique » du promoteur qui contrôle la GFP. 4.3 : BMP4 a un effet inhibiteur sur l’expression de la GFP ce qui veut dire que le promoteur de Sox1 est moins activé et donc que l’induction neurale est inhibée. Noggin a un effet inverse et est un fort stimulateur de l’induction neurale. On sait que Noggin est un inhibiteur des BMP. Cela veut dire aussi qu’en dehors d’un traitement spécifique avec BMP4, les cellules produisent de manière endogène du BMP que Noggin est capable de piéger. 4.4 : L’inhibition de la calcineurine abolit l’activation du promoteur de Sox1 ce qui suggère que la calcineurine est nécessaire à l’induction neurale. En présence de Noggin, sans calcineurine active, l’induction neurale est nettement plus faible qu’en présence de calcineurine active. Néanmoins, elle a lieu ce qui montre que la calcineurine n’est pas complètement indispensable mais est un stimulateur de l’induction neurale. 4.5 : Le traitement avec BMP4 comme attendu augmente fortement la phosphorylation de Smad1/5 et le traitement avec Noggin fait disparaître la faible phosphorylation visible dans les cellules non traitées (signe qu’il y avait de la signalisation BMP d’origine endogène aux cellules). Pour ce traitement Noggin, on constate une baisse inattendue du niveau total d’expression de Smad5, alors que le niveau contrôle d’actine est le même que dans les autres puits et que le niveau total de Smad1 est normal. L’inhibition de la calcineurine augmente la phosphorylation de Smad1/5 ce qui montre qu’en temps normal, la calcineurine s’oppose à la voie de signalisation BMP. Sans la calcineurine active, le traitement par Noggin laisse « échapper » quand même une très faible phosphorylation de Smad1/5 mais il est difficile d’interpréter avec un niveau de Smad1 et de Smad5 total plus important qu’avec Noggin seul. 4.6 : TBP est une protéine nucléaire (c’est un élément d’un facteur de transcription central) et donc son étude permet de vérifier que la purification des fractions nucléaires et cytoplasmiques a été bien faite. On constate d’ailleurs qu’il y a un peu de TBP dans la fraction cytoplasmique ce qui indique qu’elle n’est pas totalement pure et a été contaminée avec des protéines nucléaires mais le niveau est très faible par rapport à la fraction nucléaire. La tubuline est une protéine cytoplasmique donc c’est le contrôle pour la fraction correspondante. 4.7 : BMP4 renforce les diverses phosphorylations de Smad1 et de Smad5 dans la fraction cytoplasmique et surtout dans la fraction nucléaire. On voit aussi plus de protéines Smad1 et Smad5 totales dans le noyau. La signalisation activée par BMP4 provoque l’entrée de Smad1 et de Smad5 dans le noyau (associée à Smad4 qui n’est pas étudié ici). BMP4 ne change pas l’expression et la répartition de la calcineurine CnB1. 4.8 : L’inhibition de la calcineurine augmente la présence des Smad1/5 phosphorylées dans le noyau mais pas autant que BMP4. Les inhibiteurs de la calcineurine ne changent pas la quantité et la répartition de la protéine ce qui montre qu’ils n’agissent pas sur son expression ou son adressage. 4.9 : L’acide okadaïque n’a pas les mêmes effets que les inhibiteurs plus spécifiques FK/CsA. Donc cette expérience permet de montrer l’aspect spécifique de la fonction de la calcineurine. Ce n’est pas n’importe quelle phosphatase qui a ses effets mais seulement la calcineurine. 4.10 : Proposition de modèle : BMP inhibe l’induction neurale en inhibant la transcription de Sox1 via la phosphorylation et l’entrée dans le noyau de Smad1/5. La calcineurine s’oppose à l’action des BMP en déphosphorylant Smad1/5 et en empêchant leur entrée dans le noyau.

5.1 : A la fin de la neurulation (les crêtes neurales sont spécifiées et prêtes à migrer). 5.2 : Le domaine intracellulaire de Notch est libéré de la protéine transmembranaire lorsque la voie Notch est activée. Ici, on cherche à avoir une activation constitutive de la voie Notch, même en l’absence de ligand. 5.3 : NICD ne peut entrer dans le noyau qu’au moment souhaité par l’expérimentateur. Son action est ainsi inductible car NICD soit rentrer dans le noyau pour activer la transcription. 5.4 : L’expression de la β-galactosidase visible après incubation avec du Xgal permet de reconnaître le côté (gauche ou droit) où l’embryon a été injecté. Le côté opposé sert de contrôle interne. 5.5 : On observe une expression plus étendue et plus intense de 2 marqueurs de crêtes neurales. On en déduit que l’activation constitutive de la voie Notch suffit à augmenter la spécification des cellules en crêtes neurales (CCN). On ne peut formellement pas exclure qu’il y a une plus grande prolifération de CCN déjà spécifiées. 5.6 : Su(H) est le facteur de transcription auquel s’associe NICD dans le noyau pour contrôler l’expression de ses gènes cibles. 5.7 : L’activation constitutive de Su(H) a les mêmes effets que l’activation constitutive de son inducteur Notch donc c’est cohérent. Le résultat montre que Notch agit bien par la voie de signalisation classique et non pas par une voie moins « canonique ». 5.8 : un dominant-négatif est une protéine (ou un gène muté codant une protéine) qui non seulement est inactive mais aussi empêche les protéines normales d’agir. On observe l’effet inverse de l’activation constitutive de Notch et de Su(H) avec une expression nettement plus faible de Xslug et de FoxD3. Cela montre que la signalisation Notch est nécessaire à la bonne spécification des CCN et qu’elle a bien un rôle endogène normal (l’expression des formes constitutivement actives des premières expériences n’a fait qu’amplifier une signalisation qui existe déjà et non pas introduit une signalisation complètement nouvelle).

6.1 : Ce rapport permet de tenir compte des variations de transfection et de ne tenir compte de la part d’expression de la luciférase qui ne dépend que des séquences de fixation LEF/TCF (donc de l’activité de la voie de signalisation Wnt/β-caténine). 6.2 : L’activité luciférase spécifique liée à la voie Wnt/β-caténine en présence de WNT3A est augmentée si l’expression de AAK1 est inhibée. En cas de surexpression de AAK1, on obtient l’inverse, ce qui montre bien qu’AAK1 est nécessaire et suffisant pour inhiber la voie Wnt/β-caténine. Par contre, sa surexpression ou son absence ne change à la réponse cellulaire à un inhibiteur de GSK3β. Cela indique que AAK1 agit en amont de GSK3β. 6.3 : Tandis que l’inhibition de l’activité de la voie Wnt/β-caténine est diminuée de moitié environ en présence de AAK1, il n’y a plus d’inhibition lorsque son activité kinase est abolie ou lorsqu’il manque une partie de la protéine. C’est cette partie qui doit contenir le domaine qui intervient pour inhiber la voie Wnt. 6.4 : Sans la clathrine, l’activation de la voie Wnt/β-caténine en réponse à WNT3A est nettement plus faible et la présence ou l’absence de AAK1 ne change plus l’activation de cette voie. On en déduit qu’en temps normal, la clathrine (et probablement son rôle dans l’endocytose) est importante pour l’activation de la voie Wnt mais que AAK1 a besoin de la clathrine pour avoir un effet sur cette voie. 6.5 : L’implication de la clathrine a suggéré que l’endocytose était impliquée dans les processus observés. La clathrine pourrait cependant jouer d’autres rôles dans la cellule. Il s’agit de vérifier que c’est bien l’endocytose médiée par la clathrine qui a un effet sur le système. On cherche aussi à vérifier l’interaction de l’inhibition de cette endocytose avec une perte d’expression d’AAK1. Cette vérification est positive. Avec une dose modérée de l’inhibiteur de l’endocytose, on peut voir que l’on affecte spécifiquement l’effet de l’inhibition d’AAK1 sans affecter l’action de Wnt3A. 6.6 : AAK1 est un inhibiteur de la voie Wnt/β-caténine qui agit en amont de GSK3β et la nécessité de l’endocytose médiée par la clathrine pour le voir agir indique qu’il est actif à cette étape là. L’endocytose des récepteurs (ou des co-récepteurs) d’un ligand est un point de contrôle important d’une voie de signalisation. AAK1 doit agir via son domaine kinase dont il doit phosphoryler une protéine cible (on peut imaginer que c’est la clathrine ou une protéine associée).

7.1 : L’expression de Gli1 est activé par la voie Hedgehog et ensuite c’est un facteur de transcription activateur des gènes cibles de cette voie. 7.2 : L’ajout du milieu avec Wnt1 augmente la quantité de β-caténine dans le cytoplasme comme attendu, et on sait par d’autres expériences que cela est dû à l’inhibition de sa dégradation mais cet effet n’a pas lieu en présence de Gli1 (rapport proche de 1). Gli1 ou ses gènes cibles s’opposent donc à la voie de signalisation canonique Wnt en amont de la stabilisation de la β-caténine. 7.3 : La β-caténine agit dans le noyau. En s’associant avec les facteurs de transcription LEF/TCF elle active la transcription de gènes cibles. Ici, on n’observe que l’accumulation dans le cytoplasme qui se traduit en général par une entrée dans le noyau. Il faudrait étudier par western-blot les extraits nucléaires ou étudier l’expression d’un gène rapporteur sous le contrôle de séquences consensus de fixation de LEF/TCF. 7.4 : Il fixe le ligand des récepteurs Frizzled transmembranaires qui sont en compétition avec lui. Par conséquent, l’expression de sFRP-1 aura un effet inhibiteur sur la voie Wnt. 7.5 : En absence de sFRP-1 causée par le siARN, l’effet inhibiteur de Gli1 sur la stabilisation de la β-caténine n’existe plus. Par conséquent, sFRP-1 est nécessaire pour que Gli1 puisse agir et inhiber la voie Wnt. 7.6 : Sachant que Dkk est une cible de la voie Wnt canonique, on teste si l’accumulation de β-caténine dans le cytoplasme observée en A se traduit par une entrée dans le noyau et une activation de la transcription. C’est effectivement ce que l’on constate et les effets observés sont tout à fait similaires à ceux obtenus en A. Gli1 et sFRP-1 n’ont pas d’action particulière en aval de l’accumulation cytoplasmique de la β-caténine. 7.7 : La cyclopamine inhibe Smoothened dont elle inhibe la voie Hedgehog. 7.8 : Dans les cellules SIIA, la voie Hedgehog est naturellement active donc pas besoin de transfecter Gli1. On observe les même résultats que pour les HEK transfectées par Gli1. Lorsque la voie Hedgehog est inhibée par la cyclopamine on retrouve une accumulation cytoplasmique de β-caténine en présence de WNT. 7.9 : La voie Hedgehog active l’expression de Gli1 qui stimule l’expression de sFRP-1 qui inhibe la voie Wnt. Il faudrait étudier par RT-qPCR ou par western-blot l’expression de sFRP-1 en présence ou en absence de Gli1.

8.1 : On observe qu’une position du séquençage est représentée par deux nucléotides différents ce qui indique que les 2 allèles présents dans le génome des patients n’ont pas la même séquence (hétérozygotie). L’un des allèles chez les patients présente un C à la place d’un T. Si c’est la mutation qui est à l’origine du phénotype (à prouver) alors elle serait dominante. 8.2 : L’allèle muté code une protéine avec une arginine à la place d’une cystéine en position 342. C’est un changement d’un type d’acide aminé en un type d’acide aminé très différent ce qui laisse à penser que l’effet sur la conformation de la protéine sera significatif d’autant plus que cette cystéine est très conservée chez les Mammifères, contrairement à d’autres acides aminés voisins. 8.3 : On observe une augmentation relative de la phosphorylation de FGFR et de ERK lorsque la protéine est mutée par rapport à la protéine sauvage alors les quantités totales de ces protéines sont les mêmes. Cela indique une hyperactivation de la voie FGFR/ERK en présence de FGF. On ne sait pas si c’est une activation constitutive car il aurait fallu aussi cultiver les cellules dans un milieu sans FGF.

9.1 : La surexpression de la β-caténine dans la région ventrale lui permet de compenser la dégradation causée par la phosphorylation par GSK3beta et l’accumulation résultante de β-caténine lui permet d’entrer dans le noyau et d’activer un cascade d’expression de gènes qui mène à la formation d’un nouvel organisateur de Spemann qui induit un deuxième axe. 9.2 : Les mutations introduites dans la séquence de la β-caténine diminuent fortement les capacités de la β-caténine à induire une deuxième axe. Cette diminution est levée si on ajoute une séquence NLS qui permet l’entrée dans le noyau, suggérant que la forme mutante de la β-caténine a des difficultés à entrer dans le noyau et l’ajout de ce NLS a permis de compenser cette déficience. Cela suggère que les acides aminés mutés jouent un rôle important pour l’importation de la β-caténine dans le noyau.

10.1 : On teste la localisation du domaine intracellulaire de Notch1, révélée ici par la GFP dans la protéine-fusion. Lorsque Notch1 n’est pas activé, ce domaine devrait être à la membrane plasmique. En présence d’un ligand de Notch1, ce domaine est clivé et migre dans le noyau. On cherche ici à savoir si CB-103 perturbe ce clivage et cette translocation dans le noyau.Le DAPI est une molécule qui devient fluorescente lorsqu’elle est stimulée par des UV lorsqu’elle est associée à de l’ADN double-brin. Le DAPI nous permet de connaître la localisation de l’ADN dans la cellule et donc la position du noyau. Nous constatons qu’en absence ou en présence de CB-103, N1-ICD-GFP se trouve exclusivement dans le noyau avec la même intensité (une cellule avec CB-103 a une intensité plus faible mais il n’y a aussi pas de signal à la membrane ou dans le cytoplasme et il est aussi exclusivement présent dans le noyau. La différence générale d’intensité est liée à des variations d’efficacité de transfection). CB-103 n’a donc pas d’effet sur la localisation de N1-ICD donc pas d’effet sur les premières étapes de la voie de signalisation. 10.2 : L’expression de la protéine rapportrice luciférase qui dépend de l’association entre RBPJ et N1-ICD est inhibée en présence de CB-103. Cela indique que cette molécule bloque l’étape d’activation de la transcription des gènes-cibles de la voie Notch. 10.3 : L’inhibition de l’activation de la transcription par CB-103 n’est pas dû à un défaut de clivage de Notch1, ni d’un défaut de la translocation de N1-ICD dans le noyau. C’est donc une étape plus tardive qui est affectée, par exemple l’association avec RBPJ ou un effet en aval de cette association qui aboutit à l’activation de la transcription des gènes cibles. 10.4 : L’expression croissante de MAML1 aboutit à sauver l’activation de la transcription du gène rapporteur en présence de CB-103. Cela indique que l’étape bloquée par CB-103 correspond au recrutement de MAML1 et que la surexpression de MAML1 permet de compenser ce blocage.

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