La neurulation

par Patrick PLA, Université Paris-Saclay

Neurulation chez deux embryons d’axolotl (Amphibien Urodèle). Source : compte Twitter de Carole LaBonne

*Tube neural d’un embryon de poulet qui vient de se refermer. Image d’une coupe transversale d’embryon de poulet vue en microscopie électronique à balayage donnée par Eric Théveneau, CBI Toulouse. La structure du neuroépithélium se distingue bien des structures mésenchymateuses autour. Des cellules de crêtes neurales émergent de la partie la plus dorsale du tube neural (en haut).

La neurulation est une étape du développement où l’attention est essentiellement centrée sur l’ectoderme, bien que les cellules des autres feuillets avancent dans leur programme de détermination et de différenciation. C’est au cours de cette étape que l’ectoderme se sépare en différentes parties : une partie neurale, une partie épidermique et chez les Vertébrés, une partie intermédiaire entre les deux appelée la bordure neurale. La partie neurale devient le tube neural générant la moelle épinière et le cerveau et la bordure neurale donne naissance aux cellules de crêtes neurales et aux placodes.

*La partition de l’ectoderme en trois territoires durant la neurulation. Double hybridation in situ d’une jeune neurula de xénope, ici en vue dorsale, avec une sonde reconnaissant l’ARNm de Sox2 et une autre sonde reconnaissant l’ARNm de EpK (kératine épidermique). Photo : Mansour Alkobtawi

*Neurula de xénope en vue dorsale (légèrement de côté). La plaque neurale céphalique (qui deviendra le cerveau) est élargie par rapport à la plaque neurale médullaire (qui deviendra la moelle épinière). Les bourrelets neuraux se sont soulevés et sont en train de se rapprocher dans le plan sagittal.

*Neurulation chez un embryon de poulet

Chez l’Homme, les bourrelets neuraux se soulèvent au 23^ème jour après la fécondation et la fusion de ces bourrelets générant le tube neural a lieu au 28^ème jour après la fécondation pour la partie médiane et respectivement au 29^èmeet au 30^ème jour pour la partie antérieure et la partie postérieure.

La dépression dans la plaque neurale qui initie la formation de la gouttière neurale dépend de la constriction apicale des cellules de la ligne médiane qui ont un rôle moteur essentiel (Haigo et al., 2003 ; Nishimura et Takeichi , 2008 ; Nishimura et al., 2012 ; McShane et al., 2015). La constriction apicale dépend des interactions entre l’actine et la myosine. Des régulateurs de l’actine et de la myosine sont nécessaires pour la fermeture de la plaque neurale (Brouns et al. , 2000 ; McGreevy et al., 2015).

**Le régulateur du réseau d’actine p190Rho-GAP est nécessaire à la neurulation. p190Rho-GAP est un inactivateur de la petite GTPase Rho qui participe à l’organisation des microfilaments d’actine dans la cellule. (A, B) Tête d’embryon sauvage (A) ou mutant p190Rho-GAP-/- (B) à E15.5. La flèche en B indique une exencéphalie (absence de fermeture antérieure du tube neural). (C-D) Images de microscopies électroniques à balayage de vues frontales d’embryons de E10,5 sauvage (C) et mutant p190Rho-GAP-/- (D), montrant le tube neural antérieur ouvert dans les embryons mutants. f = prosencéphale (cerveau antérieur); m = mésencéphale. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/127/22/4891/41024/The-adhesion-signaling-molecule-p190-RhoGAP-is

*Rôle de la ceinture d’adhérence et de la constriction apicale lors de la neurulation. Source : https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap4/co/module_Chap4_9.html

La perte du régulateur de l’interaction actine-myosine Shroom entraîne une augmentation de la surface cellulaire apicale dans le neuroépithélium crânien, ce qui correspond à un défaut de constriction apicale (McGreevy et al., 2015). Au contraire, la surexpression de Shroom provoque une constriction apicale ectopique de cellules de l’ectoderme qui ne participent habituellement pas au tube neural (Haigo et al., 2003). Shroom agit en contrôlant la localisation de ROCK (Rho-associated kinase) qui phosphoryle et active la myosine-II non musculaire en la phosphorylant sur sa sérine 19 (Amano et al., 1996). ROCK phosphoryle aussi et inhibe MYPT qui habituellement déphosphoryle et inactive la myosine-II.

**Interaction directe entre Shroom (ici Shrm2) et ROCK qui provoque directement et indirectement le renforcement de la phosphorylation de la myosine-II non musculaire et son action sur la réorganisation du cytosquelette et le changement de forme des cellules (dont la constriction apicale). Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)34530-0/fulltext

Des réarrangements planaires sont aussi nécessaires pour les mouvements de la neurulation (Williams et al., 2014 ; Sutherland et al., 2020) et ils contribuent à rétrécir et à plier la plaque neurale. Aux stades ultérieurs de la fermeture, les cellules aux bords de la plaque neurale forment des protrusions avant l’apposition au début des événements de fusion épithéliale (Pai et al., 2012). Des filopodes sont présents aux extrémités des plis neuronaux chez la souris (Massarwa et Niswander, 2013 ; Pyrgaki et al., 2010), ainsi qu’un enrichissement en F-actine le long de la frontière entre le neuroectoderme et l’ectoderme non neural (Hashimoto et al., 2015).

Pour la dernière étape de la neurulation où a lieu une «fusion» épithéliale, les cellules individuelles ne fusionnent pas réellement les unes avec les autres, mais les cellules situées aux bords des tissus apposés forment des adhérences de novo pour créer un épithélium continu. La fermeture du tube neural implique ainsi un type particulier de fusion épithéliale, dans laquelle deux tissus distincts doivent fusionner et se remodeler : le neuroépithélium pseudostratifié et l’ectoderme de surface squameux. Initialement, chacun de ces deux tissus forment une couche ectodermique continue ; cependant, lors de la fusion du pli neural, la continuité de cet épithélium est interrompue aux jonctions bilatérales NE/ES, et de nouvelles adhérences se forment entre les épithéliums accolés de chaque côté. Le remodelage produit alors le tube neural fermé recouvert par le futur épiderme, lui aussi continu.

***Schéma des événements finaux de la neurulation dans la région troncale de l’embryon de souris.
Les plis neuraux d’apposition présentent des protrusions cellulaires à partir de leurs extrémités (à gauche), les plis neuraux subissent ensuite une fusion (au milieu) et les deux épithéliums se remodèlent pour générer un tube neural fermé recouvert d’ectoderme de surface. D’après https://elifesciences.org/articles/13273

La neurulation s’accompagne aussi de changements d’adhérences cellulaires. L’ectoderme de la souris exprime initialement la E-cadhérine mais au cours de la neurulation, la plaque neurale destinée à devenir le tube neural, éteint l’expression de la E-cadhérine et exprime la N-cadhérine à la place. Si ce changement est bloqué, la séparation des deux tissus, ectoderme non neural et neurectoderme, se fait mal.

*L’absence de N-cadhérine provoque une déformation du tube neural chez la souris. Deux embryons de souris à E8,5 sauvage (A) et N-cad-/- (B) en vue dorsale. Notez le tube neural ondulé du mutant et les somites également mal formés chez lui. Cependant, des études complémentaires montrent que l’architecture épithéliale du neurectoderme semble normale chez les souris N-cad-/- indiquant qu’une autre cadhérine compense son absence. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160696984432

*Neurulation chez l’embryon de la souris. Images en microscopie électronique à balayage de souris à 7 somites (A), 12 somites (B) et 24 somites (C). On peut constater que la fermeture du tube est précoce dans la zone médiane du corps mais que le tube est encore ouvert aux deux extrémités. Ne pas tenir compte des encadrés i. Barres d’échelle = 100 µm. Source : https://elifesciences.org/articles/13273

L’échec de la fermeture complète du tube neural entraîne des malformations congénitales : anencéphalie quand pas de fermeture à l’avant et spina bifida quand pas de fermeture à l’arrière. Les anomalies de fermeture du tube neural sont parmi les malformations congénitales humaines les plus courantes, affectant 1 grossesse sur 1000 dans le monde (Copp et al., 2013). Comprendre les mécanismes par lesquels la plaque neurale des vertébrés se replie et fusionne pour former un tube neural fermé est donc d’une importance primordiale pour mieux comprendre l’origine de ces anomalies et pour développer des méthodes pour leur prévention. Les voies de signalisation impliquées commencent à être élucidées. Par exemple, les mouvements initiaux de convergence et d’extension qui rétrécissent et allongent la plaque neurale sont régulés par la voie de polarité cellulaire planaire Wnt non canonique (Wnt-PCP) (Wallingford et Harland, 2002 ; Williams et al., 2014 ; Lopez-Escobar et al., 2018).

**La perte-de-fonction par traitement morpholino Vangl2 (un élément de la voie de signalisation Wnt/PCP) conduit à une convergence/extension défectueuse. Enregistrement en accéléré d’un témoin (à gauche) et d’un embryon de morphant Vangl2 (à droite). Les cellules de la plaque neurale sont en violet. Intervalle de temps = 3min. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/149/13/dev200358/275885/Distinct-spatiotemporal-contribution-of

La flexion de la plaque neurale des mammifères à des points de charnière médians et dorsolatéraux est régulée par la signalisation Shh et BMP (Ybot-Gonzalez et al., 2007).

Chez tous les vertébrés étudiés à ce jour, le facteur de transcription Sox2 est un marqueur général très précoce de la plaque neurale en développement. Chez le poulet, par exemple, l’expression de Sox2 commence au stade de la ligne primitive tardive (stades HH 4–4+) dans le futur territoire neuronal. Une plaque neurale morphologiquement reconnaissable ne devient visible qu’après le début de l’expression de Sox2.

Le profil d’expression complexe de Sox2 est contrôlé par plusieurs éléments régulateurs, chacun étant responsable de diriger l’expression vers un sous-ensemble spécifique de sites d’expression. Une analyse des régions non codantes de Sox2 dans l’embryon de poulet a révélé jusqu’à 25 enhancers distincts conservés, dont deux expliquent l’expression de ce gène dans la plaque neurale précoce. L’un de ces enhancers, nommé N2, est responsable de l’expression initiale (stade 4-4+) et est activé dans un large domaine correspondant à l’ensemble du cerveau antérieur/mésencéphale et à la majeure partie du cerveau postérieur. L’autre enhancer, N1, pilote l’expression dans la partie la plus postérieure du futur cerveau et dans la moelle épinière et il est activé un peu plus tard (autour du stade 5). L’expression de Sox2 via l’élément N1 est activée par l’action conjointe des voies de signalisation Wnt et FGF (Uchikawa et al., 2003; Takemoto et al., 2006; Bouzas et al., 2016). Le facteur de transcription PRDM1 joue également un rôle important : il recrute l’histone déméthylase Kdm4a qui déméthyle les marques répressives H3K9me3 ce qui rend possible l’activation de la transcription de Sox2 (Prajapati et al., 2019).

**Activation de l’expression de Sox2 par PRDM1. Les régions en 5′ du site de début de la transcription de Sox2 (TSS) contiennent 4 sites de liaison sur l’ADN pour PRDM1 (barres oranges et les séquences consensus de ces sites sont rappelés dans l’encart). En haut, à droite, des expériences de ChIP-qPCR ont été réalisées à partir de chromatine d’épiblaste (ou futur ectoderme) de poulet d’avant la gastrulation (cEpi), de bordure neurale (NpB) et de plaque neurale (eNP). Les barres grises foncés à gauche représentent les résultats avec les contrôles avec une ChIP-qPCR réalisées avec des anticorps contrôle, les autres barres grises représentent les résultats avec les contrôles avec une ChIP-qPCR réalisées avec des anticorps anti-PRDM1. La qPCR sur le culot de la ChIP a été prévue pour amplifier des séquences de fixation de PRDM1 sur le promoteur de Sox2. En bas, la ChIP-qPCR a été réalisée avec des anticorps anti-H3K9me3 qui est une marque répressive de la transcription. La chromatine a été extraite de cEpi, NpB et eNP mais aussi des progéniteurs sensoriels de placode (SP) et de plaque neurale où on a inhibé l’expression de PRDM1 (eNP*). On constate que PRDM1 se fixe sur le promoteur de Sox2 dans la plaque neurale spécifiquement et qu’il y est nécessaire pour éliminer les formes H3K9me3 répressives de la transcription. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/24/dev181107/223060/PRDM1-controls-the-sequential-activation-of-neural

Sox2 est nécessaire et suffisant pour produire du tissu neural. Par exemple, l’expression ectopique de Sox2 dans le mésoderme présomitique induit la formation de tissu neural dans des cellules qui devraient contribuer aux somites (Takemoto et al., 2011)

*L’expression ectopique de Sox2 est suffisante pour changer la destinée des futures cellules somitiques en tissu neural. Des souris transgéniques sont générées qui permettent d’exprimer Sox2 dans du mésoderme présomitique grâce à un promoteur spécifique de cette région. On réalise des coupes dans les embryons obtenus. Les coupes sont de plus en plus antérieures du haut vers le bas (neurulation pas encore achevée dans la région la plus postérieure). On réalise une immunofluorescence permet de détecter la présence de Sox2 et de Pax6, un marqueur de tube neural On constate qu’en dehors de ce tube, Pax6 est aussi exprimé dans des groupes de cellules latérales dans le mésoderme pré-somitique exprimant Sox2 (flèches). Source : https://www.nature.com/articles/nature09729

La plaque neurale est significativement plus large dans la région crânienne par rapport à la moelle épinière, ce qui suggère que des mécanismes distincts sont nécessaires pour la fermeture du cerveau en développement. De plus, des signaux régionalisés produisent des destins cellulaires distincts le long de l’axe antéro-postérieur et dorso-ventral du tube neural.

Les positions dorso-ventrales correspondent à des positions médiolatérales dans la plaque neurale avant la fermeture du tube neural. Les identités neuronales à différentes positions médio-latérales dans la plaque puis dorso-ventrales dans le tube sont régulées par les protéines sécrétées Shh, Wnt et BMP, avec des niveaux élevés de Shh produisant des destins cellulaires ventraux, des niveaux modérés de Shh produisant des destins cellulaires intermédiaires et des niveaux élevés de Wnt et BMP produisant des destins cellulaires dorsaux (Dessaud et al., 2008 ; Sagner et Briscoe, 2019). Une polarité antéro-postérieure est aussi établie.

*Les gradients dans le tube neural établissent des axes de polarité dans le système nerveux central. Les gradients de BMP/Wnt et celui de Shh établissent une polarité dorso-ventrale dans le tube neural (avec les motoneurones (MNs) par exemple qui se développent dans la région ventrale) et les gradients de FGF/acide rétinoïque (RA) et Wnt établissent une polarité antéro-postérieure (avec, de manière simplifiée, FGF exprimé aux extrémités antérieure et postérieure du tube neurale et l’acide rétinoïque dans les régions intermédiaires). Source : https://stemcellres.biomedcentral.com/articles/10.1186/scrt476

La bordure neurale qui se situe entre le futur tube neural et le futur épiderme donne deux types de cellules : les cellules de la crête neurale (CCN) et les cellules des placodes (pour ces dernières seulement dans la bordure neurale antérieure). Les CCN donnent naissance à la plupart des neurones et des cellules gliales du système nerveux périphérique, aux cellules de la médullosurrénale, à une grande partie du squelette craniofacial, aux mélanocytes et aux vaisseaux à la sortie du cœur. Les placodes forment l’épithélium olfactif, l’oreille interne, le cristallin de l’œil et certains neurones des ganglions crâniens.

**Expression de gènes sélectionnés au cours du développement précoce de la bordure neurale du xénope. Expression de certains des marqueurs les plus couramment utilisés pour l’ectoderme non-neural, la bordure neurale et le tube neural. Rangée supérieure : vues dorsales d’embryons de xénope au stade de la plaque neurale (stade 14, Nieuwkoop et Faber, 1994), avec la région antérieure vers le haut traités par hybridation in situ : Pax3, Zic1 et Msx1 sont exprimés à la bordure neurale, l’expression de Six1 délimite l’ectoderme préplacodal qui donne naissance aux placodes, Sox2 est exprimé dans la plaque neurale et Epk marque l’ectoderme non neural. Notez le chevauchement partiel entre Pax3 et Sox2 dans la plaque neurale latérale correspondant à la future partie dorsale du tube neural ; et aussi le chevauchement de Zic1 et Six1 dans l’ectoderme préplacodal. Barre d’échelle : 500 µm. Rangée inférieure : Coupes transversales d’embryons de xénope au stade 14 traités par hybridation in situ pour les gènes indiqués. Pax3, Zic1 et Hes4 sont exprimés dans la bordure neurale, Sox2 est exprimé dans la plaque neurale avec une chevauchement partiel avec Pax3 dans la plaque neurale latérale et Epk est exprimé dans l’ectoderme non neural. Barre d’échelle : 100 µm. Source : Pla et Monsoro-Burq, 2018

La co-immunolocalisation de marqueurs de la plaque neurale (Sox2), de la bordure neurale (Pax7), de la bordure neurale et de l’ectoderme non-neural (Tfap2a, Msx1/2) et des progéniteurs de la placode (Six1) a montré que ces marqueurs se chevauchent largement dans les cellules de la bordure neurale chez le poulet (Roellig et al., 2017). Cette co-expression de plusieurs marqueurs est maintenue du début de la neurulation jusqu’à la fermeture du tube neural. En supposant que chacun de ces marqueurs prédit fidèlement des destins cellulaires distincts, cette étude indique que la bordure neurale n’est pas divisée en régions à destins bien définis avant la fermeture du tube neural. Ce n’est qu’après que les différents territoires se définissent précisément.

Une fois les territoires définis, ils ont des modalités de développement propre. Dans le tube neural en cours de fermeture, les cellules neuroépithéliales prolifèrent. Avec le début de la neurogenèse, ces cellules deviennent des cellules de la glie radiaire (cellules souches neurales) qui se divisent d’abord par division symétrique ce qui augmente leur pool. Puis des divisions asymétriques apparaissent permettant de régénérer les cellules souches neurales et de produire des précurseurs de neurones et de cellules gliales.

*Production de précurseurs neuronaux et gliaux dans le tube neural. Les cellules souches neurales ont des caractéristiques de cellules de la glie radiaire. A l’approche de la mitose, leurs prolongements se rétractent et leur noyau se rapproche de la surface apicale (à côté de la lumière du tube neural). La division est asymétrique et génère une cellule qui ne produira plus de prolongements apico-basaux et qui sera un précurseur neuronal ou glial (qui pourra proliférer puis se différencier). La cellule souche neurale s’autorenouvelle grâce à cette division asymétrique. D’après https://journals.biologists.com/dev/article/134/10/1943/52765/Mitotic-spindle-orientation-distinguishes-stem

Des expériences de suivi de cellules marquées avec un gène rapporteur introduit par un vecteur rétroviral dans le tube neural d’un embryon de poulet ont montré que ce sont les mêmes cellules souches neurales qui donnent naissance aux neurones et aux cellules gliales (Leber et al., 1990).

Lorsqu’on différencie des cellules souches pluripotentes en cellules souches neurales in vitro, elles prennent la forme de rosettes, mimant la polarité apico-basale du tube neurale.

**Rosette composée de cellules souches neurales. En B, immunofluorescence avec un anticorps anti-SOX2 (bleu) et un anticorps anti-Nestine (rouge), un marqueur de cellules souches neurales. Source : https://www.eurostemcell.org/unlocking-natures-secrets-building-human-brain

Des équipes de recherche travaillent également à faire mimer in vitro à des cellules dérivées des cellules souches pluripotentes humaines les mouvements de la neurulation (Karzbrun et al., 2021).

***Système de culture en 3D permettant de suivre une neurulation avec des cellules humaines. Inspirés de l’organogenèse in vivo, un feuillet bidimensionnel géométriquement contrôlé de cellules souches pluripotentes humaines polarisées en contact avec une cavité est généré (vert) par le Matrigel qui déclenche une transition de la culture 2D contrainte vers un épithélium monocouche pluripotent 3D qui s’est enroulé autour d’une seule cavité. Le tissu 3D a maintenu la pluripotence et pourrait donc donner naissance à de nombreux types de cellules du corps humain. La formation du tube neural (rouge) est déclenchée en appliquant des molécules mimant ce qu’il se passe in vivo lors du développement neurologique précoce : un inhibiteur de TGFβ (SB-431542), suivi d’une exposition à BMP4. Il en résulte un tissu neural en forme de tube recouvert d’ectoderme de surface, récapitulant plusieurs caractéristiques anatomiques du tube neural embryonnaire. L’expression de la E-cadhérine (futur épiderme) et de la N-cadhérine (neuroépithélium) est suivi par immunofluorescence et montre des similitudes importantes avec la situation in vivo. Les temps indiqués ont pour origine le traitement par BMP4. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8828633/

Pour voir les modalités de la délamination et de la migration des crêtes neurales, voir cette page.

À la fin de la neurulation et au début de l’organogenèse, tous les embryons de Vertébrés se ressemblent (malgré des premières étapes du développement assez divergentes, notamment à cause de la quantité et de la répartition du vitellus) : c’est le stade phylotypique.

*Modèle du sablier. Le développement des Vertébrés est très divergent lors des premières étapes puis converge vers un stade phylotypique qui signe la parenté évolutive entre tous les Vertébrés avant de diverger à nouveau lors de l’organogenèse propre à chaque phylum. Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Stade_phylotypique#/media/Fichier:Mod%C3%A8le_du_sablier.png

De nouvelles techniques de différenciation in vitro de cellules souches pluripotentes (ES ou iPS) de souris permettent d’obtenir des embryoïdes capables d’effectuer une gastrulation et une neurulation assez proches de ce qu’il se passe in vivo (Lau et al., 2022).

**Obtention d’embryoïdes de souris au stade de la neurulation. En combinant des cellules ES « naïves » (orange) avec des cellules ES transfectées pour exprimer Cdx2 (ce qui les oriente vers une différenciation en ectoderme extraembryonnaire et en chorion, bleu) ou pour exprimer Gata4 (ce qui les oriente vers une différenciation en endoderme viscéral/vésicule vitelline, gris), on obtient une topologie favorable pour qu’un embryoïde se développe in vitro jusqu’à la neurulation. Source : https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(22)00377-0

Le développement se poursuit avec l’organogenèse.

LIEN VERS LE GLOSSAIRE