Le développement des bourgeons de membre

Par Patrick Pla, Université Paris-Saclay

Les bourgeons de membre chiridien se développent à partir d’expansions latérales du corps. Ils apparaissent entre la 4ème et la 5ème semaine de développement chez l’embryon humain. Ils donnent les os, les tendons et l’épiderme du membre, mais d’autres cellules migrent dans le bourgeon et participent à son organogenèse.

*Le membre chiridien : une assemblée de cellules d’origine hétéroclite.
*Migration des myoblastes dans le bourgeon de membre. Hybridation in situ montrant l’expression de Pax3 dans des embryons de souris sauvages (WT) ou mutants où le gène codant BRAF a été délété dans les myoblastes. Pax3 marque le tube neural dorsal, le dermomyotome et les myoblastes en migration. NT = tube neural; dm = dermomyotome; fl = bourgeon de membre antérieur. Source : Shin et al., 2016 : https://doi.org/10.7554/eLife.18351.001

Ce sont donc des cellules de différentes origines qui vont devoir former une structure fonctionnelle et correctement régionalisée selon plusieurs axes :

l’axe proximo-distal (la succession stylopode-zeugopode-autopode)

l’axe antéro-postérieur (visible sur les doigts : le pouce est le doigt le plus antérieur, le petit doigt est le plus postérieur)

l’axe dorso-ventral (bien visible en regardant la différence entre le dos et la paume de la main). 

Etudier le développement du bourgeon de membre peut permettre une approche plus simple que pour un embryon entier pour comprendre comment une structure tridimensionnelle se met en place.

Contrôle de la position des bourgeons de membre sur l’axe antéro-postérieur de l’animal

Le bourgeon de membre antérieur se forme dans une zone où l’acide rétinoïque (RA) a une activité importante. La mutation de gène codant la rétinaldehyde déshydrogénase-2 (Raldh2), l’enzyme clé de la synthèse de RA, abolit la formation des nageoires pectorales et des bourgeons de membre antérieurs chez le poisson-zèbre et la souris (Begemann et al., 2001, Niederreither et al., 1999). Des expériences classiques ont montré que la mise en place d’une barrière imperméable entre les somites et les lames latérales à un moment critique abolit l’induction des bourgeons de membre. L’acide rétinoïque est justement produit par les somites. Il s’oppose notamment à l’action du FGF8 qui est exprimé dans le cœur et dans les régions plus postérieures et il induit l’épaississement localisé de la lame latérale externe (la somatopleure) qui est la première étape de la formation du bourgeon de membre.

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*Modèle d’induction de la formation du bourgeon de membre antérieur. L’acide rétinoïque (RA) en provenance des somites et du mésoderme latéral ainsi que les gènes Hox et la voie de signalisation Wnt/β-caténine permettent d’établir l’expression de Tbx5 dans la région de la somatopleure où va se former le bourgeon de membre antérieur. Tbx5 active FGF10 qui induit FGF8 dans l’AER et une boucle de régulation positive entre les 2 FGF se met en place. Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(15)00706-8

L’induction du développement du bourgeon de membre par l’acide rétinoïque mais aussi par Wnt2b qui est exprimé dans les somites et dans la partie médiale des lames latérales (Ng et al., 2002) induit l’expression de Tbx5 qui active ensuite FGF10 dans le mésenchyme. Dans le bourgeon de membre postérieur, c’est Tbx4 qui joue le rôle de Tbx5.

**L’expression de Tbx5 dépend de la signalisation WNT/β-caténine et est nécessaire pour activer l’expression de FGF10. (A,B) Des adénovirus exprimant Axin et EGFP ont été co-injectés dans les lames latérales d’embryons de poulet de stade 8. La surexpression de Axin inhibe β-caténine. Au stade 15, l’expression de l’EGFP marque la distribution spatiale de l’adénovirus et l’intégrité du tissu injecté (B, flèche). L’expression de Tbx5 est étudiée par hybridation in situ. Elle est abaissée du côté injecté (A, flèche). A et B sont des images du même embryon. (C) Un vecteur d’expression RCAS avec un mutant dominant-négatif de Tbx5 tronqué de sa partie N-terminale (Tbx5ΔN) a été injecté dans la région de l’aile présomptive des embryons de stade 8. Chez les embryons de stade 16 injectés avec RCAS-Tbx5ΔN, l’expression de Fgf10 étudiée par hybridation in situ est abaissée du côté injecté (flèche). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/129/22/5161/51934/The-limb-identity-gene-Tbx5-promotes-limb

FGF10 active FGF8 dans l’ectoderme qui s’épaissit et forme l’AER (pour Apical Ectodermal Ridge ou crête apicale ectodermique).

*Expression de FGF8 (G) et de FGF10 (M) vue en hybridation in situ dans un bourgeon de membre postérieur de souris à E10.5. On remarque que FGF10 est exprimé dans le mésenchyme alors que FGF8 est exprimé à l’extrémité distale du bourgeon de membre dans ce qui va devenir l’AER. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0037826

C’est ensuite la boucle de régulation positive entre FGF10 mésenchymateux et FGF8 de l’épiderme qui pousse à la croissance du bourgeon. On remarque que d’un signal inhibiteur initial, FGF8 devient un signal activateur, un exemple de plus démontrant qu’une molécule de signalisation ne porte pas d’instructions en soi et que tout dépend du contexte.

Le thalidomide, un médicament qui a été largement prescrit dans les années 1950 et 1960 avant d’être interdit aux femmes enceintes, cause des raccourcissements et des malformations des membres au cours du développement, en inhibant notamment l’expression de FGF10 et de FGF8 (Ito et al., 2010).

*Niko von Glasow, un réalisateur allemand né en 1960, victime du thalidomide. Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Niko_von_Glasow#/media/Fichier:Niko_von_Glasow.jpg

Les gènes Hox ont bien entendu leur mot à dire sur le positionnement des bourgeons de membre le long de l’axe AP. Par exemple, les bourgeons de membres antérieurs ne sont induits que dans une région qui exprime Hoxb5 mais pas Hoxc6 et Hoxc8. C’est par modification de l’expression de ces deux derniers gènes que les serpents ont perdu leur capacité à former des membres antérieurs. L’expression de Hoxc6 et Hoxc8 remonte bien plus antérieurement chez l’embryon du python comparé à l’embryon de poulet et la région où le bourgeon de membre antérieur pourrait se former n’existe plus d’un point de vue de la détermination génétique.

*Comparaison de l’expression de gènes Hox chez l’embryon de poulet et du python. Le python possède un membre postérieur vestigial mais le membre antérieur a complètement disparu.

L’axe proximo-distal et son contrôle

Le plan d’organisation du membre chiridien des tétrapodes se compose de trois segments principaux séparés par des articulations. Selon l’axe proximo-distal, depuis la paroi corporelle jusqu’à la pointe distale, il s’agit du stylopode (bras, cuisse), du zeugopode (avant-bras, mollet) et de l’autopode (main, pied). Le stylopode et le zeugopode contiennent respectivement un et deux éléments squelettiques, tandis que le segment distal ou autopode contient les multiples éléments squelettiques de la main et du pied, carpes/tarses, métacarpes/métatarses et phalanges. Cette organisation morphologique est très conservée chez les Tétrapodes malgré une variation évolutive considérable liée à des adaptations à des locomotions variées (course, saut, vol…).

Les bourgeons s’agrandissent et les éléments cartilagineux du futur squelette et les masses musculaires se mettent progressivement en place. À l’extrémité des membres chiridiens, les doigts sont initialement liés par une zone interdigitale où les cellules sont finalement éliminées par apoptose. Des différences notables sont observées entre certaines espèces comme par exemple entre la souris et la chauve-souris. Chez les bourgeons de membre antérieurs de la chauve-souris, la zone interdigitale ne meurt pas et permet de générer la surface portante de ce Mammifère volant.

L’axe proximo-distal est contrôlé par un épaississement du l’épiderme distal appelé AER (pour Apical Ectodermal Ridge ou crête apicale ectodermique), un épithélium épaissi qui borde la région distale du bourgeon de membre en croissance. Son ablation entraîne un membre tronqué de sa partie distale. L’AER produit des facteurs de croissance (famille des FGF) indispensables à la croissance du bourgeon de membre.

*AER vu en microscopie électronique à balayage. Source : https://www.sdbcore.org/object?ObjectID=322&SubTopicID=25

L’AER se caractérise par l’expression de plusieurs membres de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), dont FGF8 est le plus important (Mariani et al., 2008).

La fonction cruciale de l’AER a été révélée pour la première fois par les expériences classiques d’ablation réalisées sur l’embryon de poulet par Saunders et ses collaborateurs. L’ablation de l’AER produit des membres atrophié de leur partie distale où le niveau tronqué est précisément corrélé avec le stade où l’AER a été retiré. Ces expériences ont révélé pour la première fois que les segments de membre se forment progressivement, dans une séquence proximo-distale et ont caractérisé l’AER en tant que tissu inducteur essentiel au développement des membres, contrairement à l’hypothèse courante à l’époque selon laquelle l’ectoderme n’était qu’une structure passive et protectrice.

Afin de tenir compte des résultats des expériences d’élimination de l’AER et ainsi d’expliquer comment diverses cellules mésodermiques acquièrent leur propre information proximo-distale, Wolpert et ses collègues ont proposé le « modèle de la zone de progression ». Ce modèle postule que les cellules mésodermiques distales, sous-apicales dans la zone de progression (ZP) acquièrent progressivement des valeurs positionnelles plus distales selon le temps passé sous l’influence de l’AER. Cependant, l’épaisseur de la ZP n’a pas été définie avec précision. Bien que plusieurs gènes présentent des domaines d’expression rappelant la ZP, parmi lesquels Msx1, N-myc et Tfap2a, un marqueur de ZP fiable n’a pas été identifié.

Le modèle ZP a été réévalué à plusieurs reprises et les mécanismes et modèles par lesquels les cellules progénitrices des membres mésenchymateux acquièrent progressivement des destins plus distaux est encore un sujet de recherche actif. Des études sur des embryons de poulet soutiennent un « modèle signal-temps » où la spécification du segment de membre proximal dépend de signaux en provenance du tronc de l’embryon, tandis que la spécification des segments distaux dépend de l’activation d’un programme qui commence une fois que les progéniteurs du membre distal sont exempts de signaux proximaux en raison de la croissance du bourgeon. Ce programme implique la transition progressive d’un mode proximal à un mode distal d’expression des gènes Hox qui est contrôlé par un gradient proximo-distal des facteurs de transcription Meis sous le contrôle de la signalisation FGF provenant de l’AER.

La perte génétique conditionnelle de Meis1/2 dans le membre de la souris entraîne des défauts de structuration proximodistale.

*Meis1 et Meis2 sont nécessaires pour le développement des structures proximales du bourgeon de membre. Préparations squelettiques de mutants Meis et d’embryons WT colorés au bleu alcian/rouge alizarine à E18,5. Les mutants sont des embryons avec le système de délétion conditionnelle Cre/Lox où on restreint les mutations au bourgeon de membre. Dll1Cre;Meis1+/f;Meis2f/f (M1HT;M2KO) exprime plus de Meis2 mais a un allèle fonctionnel de Meis1 et Dll1Cre;Meis1f/f;Meis2f/f (M1M2DKO) n’exprime plus ni Meis1, ni Meis2. Source : https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aaz0742

L’application d’acide rétinoïque (RA) peut favoriser les destins proximaux (Tamura et al., 1997). L’implantation de billes chargées de RA dans les bourgeons des membres active l’expression des régulateurs transcriptionnels Meis. Meis1 et Meis2 sont d’abord exprimés dans tout le mésenchyme du bourgeon de membre naissant et leur expression se restreint de manière proximale au cours de la croissance du bourgeon. L’expression ectopique de Meis1 dans les bourgeons des membres de poulet et de souris provoque des transformations de structures distales en structures proximales, tandis que l’implantation de billes chargées de FGF8 dans le mésenchyme proximal inhibe l’expression de Meis (Capdevila et al., 1999; Mercader et al., 2000). Ces résultats ont conduit au modèle à deux signaux pour la structuration de l’axe proximo-distal, avec RA provenant du flanc de l’embryon et la signalisation FGF venant de l’AER qui s’opposent pour spécifier les identités proximale et distale, respectivement (Mercader et al., 2000). 

Comme l’AER ne se forme qu’après la formation du membre proximal, retardant ainsi la production de FGF distaux jusqu’après l’initiation du bourgeon de membre, cela entraîne une expression précoce de Meis1/2 dans tout le membre. Une fois l’AER établi, l’expression de Meis1/2 est réprimée par les FGF distaux, créant ainsi une limite d’expression de Meis1/2 qui la laisse dans une position proximale alors que le membre distal continue de croître sans expression de Meis1/2.

L’axe proximo-distal du bourgeon de membre est aussi sous le contrôle d’une partie des complexes des gènes Hox (les complexes A et D avec les parties les plus en 5′ du complexe incluant les gènes Hoxa9 à Hoxa13 et Hoxd9 à Hoxd13). La règle de colinéarité que l’on observe pour les complexes Hox et l’axe antéro-postérieur de l’embryon s’applique ici sur l’axe proximo-distal : les gènes les plus en 3′ spécifient les parties les plus proximales (humérus ou fémur) et les gènes les plus en 5′ spécifient les parties les plus distales (les doigts). De nombreuses malformations congénitales des doigts sont associées à des mutations dans HOXD13.

*Patron d’expression de Hoxd13 au cours du développement du bourgeon de membre antérieur de la souris. Etude en hybridation in situ. Notez l’expression exclusivement distale, dans les doigts. Barres d’échelle = 0,5 mm. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-25330-y

D’un côté du groupe de gènes Hox, une série d’enhancers (dans le domaine chromatinien appelé T-DOM) contrôlent l’expression proximale de Hoxd9 à Hoxd11 et de l’autre côté, une série d’enhancers (dans le domaine chromatinien appelé C-DOM) contrôlent l’expression distale de Hoxd10 à Hoxd13 (Montavon et al., 2011 ; Andrey et al., 2013). Une frontière de TAD (domaine d’activation topologique) avec des protéines CTCF attachées dessus entre les gènes Hoxd11 et Hoxd12 assurent une relative imperméabilité entre les deux séries d’enhancers, empêchant par exemple Hoxd13 d’être exprimé dans la région proximale (Rodriguez-Carballo et al., 2017).

L’axe antéro-postérieur et son contrôle

L’axe antéro-postérieur est contrôlé par la ZPA, qui est une région dans la partie postérieure du bourgeon de membre. Sa greffe dans la région antérieure d’un bourgeon de membre receveur entraîne une duplication des doigts avec une disposition en miroir.

*Greffe d’une ZPA dans un bourgeon de membre receveur normal. Au bout de quelques jours on observe le squelette du membre obtenu (f) à comparer avec un squelette normal (c). Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2017.00014/full

La greffe d’une ZPA de souris dans la partie antérieure d’un bourgeon de membre de poulet provoque également une duplication en miroir des doigts (dont les cellules seront formées à partir des cellules de poulet et non de souris, ce qui démontre une fois de plus l’induction). Cela démontre que le signal en provenance de la ZPA est conservé chez tous les Vertébrés.

Il s’est écoulé 25 ans entre la découverte de l’activité ZPA par Saunders et Gasseling en 1968 et la preuve formelle que c’est Shh qui est le morphogène impliqué produit par la ZPA (Riddle et al., 1993). Un dosage de Shh dans des portions de bourgeons de membre à l’aide d’un test biologique a montré qu’il y a 5 fois plus de Shh dans les tissus postérieurs d’un bourgeon de membre que dans les tissus antérieurs.

L’expression de Shh dans la ZPA est contrôlée par un enhancer de 800 pb, la ZRS, qui se trouve 1 Mb (1 million de paires de bases) en amont du site de démarrage de la transcription de Shh. Des mutations ponctuelles dans cet enhancer provoque des malformations des doigts chez l’Homme comme la polydactylie préaxiale de type 2, la syndactylie de type IV ou le syndrome mésomélique de Werner (Lettice et al., 2003, 2008; Farooq et al., 2010; Furniss et al., 2008; Gurnett et al., 2007; Semerci et al., 2009; Wieczorek et al., 2010). Les limites du domaine d’expression de Shh sont contrôlées au cours du développement du bourgeon par les facteurs de transcription de type Ets, Etv4 et Etv5 (Lettice et al., 2012). Si on mute leurs sites de liaison dans la ZRS, une expression ectopique de Shh apparaît dans la région antérieure du bourgeon, ce qui aboutit à des malformations digitales. GATA6 intervient également pour éviter une expression antérieure de Shh (Kozhemyakina et al., 2014).

**Action inhibitrice de GATA6 sur l’expression de Shh dans la région antérieure du bourgeon de membre postérieur. GATA6 est exprimé dans la partie antérieure du bourgeon du membre postérieur de la souris en développement (en haut) et réprime spécifiquement la polydactylie (PD) dans le membre postérieur en bloquant directement l’expression antérieure de Shh (avec l’aide des cofacteurs transcriptionnel FOG). GATA6 réprime ainsi l’expression des deux cibles transcriptionnelles directes de Shh (Gli1 et Grem1) dans le mésenchyme du bourgeon de membre antérieur et des cibles indirectes (FGF4/8) dans l’AER antérieur. Dans les bourgeons des membres postérieurs sans GATA6 (en bas), l’expression ectopique de Shh dans le mésenchyme antérieur induit l’expression de Gli2/3 sous leur forme activatrice de la transcription et aussi l’expression de Gli1 qui activent l’expression de l’antagoniste BMP Grem1, qui à son tour diminue l’expression de FGF4/8 dans la région antérieure de la crête ectodermique apicale. En conséquence, les membres postérieurs de ces animaux présentent une polydactylie préaxiale. Les gènes exprimés sont indiqués par une police noire ; les gènes éliminés ou réprimés sont indiqués en gris. Source : Kozhemyakina et al., 2014

Cette région antérieure qui s’oppose à l’expression de Shh est mise en place par Irx3/5 au début du développement du bourgeon de membre (Li et al., 2014).

Des 2 transducteurs nucléaires de Shh, Gli3 a la plus forte activité de répresseur en absence de Shh et Gli2 est l’activateur le plus puissant en présence de Shh (Sasaki et al., 1999). Gli1 n’est pas régulé par la protéolyse lors de la voie de transduction Shh comme Gli2 et Gli3, mais est lui-même une cible transcriptionnelle directe de la voie de signalisation Shh ainsi qu’un activateur transcriptionnel des cibles de Shh (Bai et al., 2002, Sasaki et al., 1999). Gli1 est en grande partie inutile pour le développement normal des membres, bien que des phénotypes de malformations subtiles des doigts se produisent chez les mutants nuls Gli1 dans le contexte d’autres mutations affectant la voie de signalisation (Park et al., 2000). Des analyses de mutants de souris ont démontré que Gli3 joue le rôle principal dans le membre, alors que Gli2 joue un rôle mineur (Bowers et al., 2012). La perte de Gli3 entraîne une polydactylie et une perte partielle de la régionalisation antéro-postérieure, suggérant qu’un gradient de Gli3 répresseur (Gli3R) peut à la fois restreindre le nombre de doigts et réguler leur identité AP (Wang et al. , 2000). De plus, Gli3 est épistatique à Shh. Le knock-out composé Shh-/-;Gli3-/- a un phénotype de membre polydactyle identique au mutant Gli3-/- seul, indiquant que le rôle majeur de Shh dans l’autopode est d’inhiber la formation de Gli3R (Litingtung et al., 2002; Welscher et al., 2002).

**La signalisation Shh dans le bourgeon de membre régule l’acétylation de H3K27 dans un sous-ensemble de régions auxquelles se lie les facteurs de transcription GLI.
(A) Schéma expérimental permettant d’identifier différentes catégories de régions liées aux facteurs GLI (GBR). Les bourgeons de membre utilisés proviennent de souris de E10,5. (B) Heatmap illustrant l’enrichissement différentiel en H3K27ac dans les bourgeons des membres WT et Shh-/- pour les GBR sensibles et insensibles (« stable ») à Shh. (C) Classification des catégories de GBR selon leur réponse obtenu en B (D-F) L’enrichissement en H3K27ac dans les bourgeons de membre WT et Shh -/- est montré dans une région génomique représentative près d’un GBR insensible (D) et des GBRs connus comme répondant à Shh : un GBR de GRE1 codant Gremlin1 (E) et un GBR de Ptch1 (F). Source : https://elifesciences.org/articles/50670

Les souris Shh-/- présentent des bourgeons de membre tronqués, réduits à leur partie proximale. C’est la conséquence du fait que SHH a également un rôle de maintien de l’AER et de sa sécrétion de FGF et en retour, les FGF de l’AER sont nécessaires au maintien de la ZPA et de sa sécrétion de SHH. Le tout constitue une boucle de rétrocontrôle positif. Le mécanisme par lequel Shh maintient FGF dans l’AER est relativement bien caractérisé et implique le contrôle par Shh des interactions entre Formine, Gremlin et les BMP. L’expression de Gremlin est initialement activée par le facteur de transcription bHLH dHand (ou Hand2) (te Welscher et al., 2002) mais c’est la voie de signalisation Shh qui le maintient.

La manipulation de l’AER en conjonction avec une exposition à Shh ou Fgf4 exogène chez l’embryon de poulet a établi que l’AER est nécessaire pour induire l’expression de Shh et peut être remplacée par Fgf4 (Laufer et al., 1994, Niswander et al., 1994). Shh, à son tour, induit l’expression de Fgf4 dans l’AER postérieur, formant une boucle de rétroaction positive entre ZPA et AER. La suppression des deux Fgf4;Fgf8 chez la souris a définitivement montré que les AER/FGFs sont essentiels pour l’initiation de l’expression de Shh dans le membre (Sun et al., 2002). Les facteurs de transcription de la famille Ets, effecteurs nucléaires des signaux FGF, sont des régulateurs clés de l’enhancer du membre ZRS de Shh (Lettice et al., 2012).

Des études génétiques chez la souris ont révélé que la cible mésodermique Shh Gremlin (Grem1), un antagoniste des BMP sécrété relaie le signal Shh à l’AER en modulant les effets négatifs des BMPs sur le maintien de l’AER (Zuniga et al., 1999). La caractérisation de l’enhancer Grem1 a révélé une régulation complexe par la voie Shh, impliquant un rôle potentiel pour GliA en plus d’un effet majeur de dérépression de Gli3R, ainsi que l’induction par les cibles Shh, Bmp2 et Bmp4 (Benazet et al., 2009, Li et al., 2014, Nissim et al., 2006, Vokes et al., 2008, Zuniga et al., 2012).

**L’activité de l’enhancer de GRE1 nécessite une signalisation Shh. (A-E′) Les membres antérieurs de souris transgéniques GRE1LacZ+/− exprimant LacZ sous le contrôle d’un enhancer de Gremlin1 ont été cultivés dans des milieux de contrôle contenant le solvant (A-E) tandis que leurs membres antérieurs controlatéraux ont été cultivés dans de la cyclopamine (A′-E′), un inhibiteur de la signalisation Shh, comme le montre le schéma (B). Le stade des bourgeons des membres au début de l’expérience est indiqué sur la gauche. (C″-E″) Graphiques indiquant la taille du domaine mesurée par le rapport de la surface colorée à la β-galactosidase à la surface totale des bourgeons des membres pour les bourgeons des membres témoins (noirs) ou traités à la cyclopamine (rouges). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/141/9/1906/19387/A-Gli-silencer-is-required-for-robust-repression

Au fur et à mesure que le bourgeon de membre s’allonge, la ZPA (et l’expression de Shh) persiste distalement dans le mésenchyme postérieur sous-jacent à l’AER. L’expression de Shh dans les cellules mésodermiques postérieures plus proximales diminue à mesure que les cellules se déplacent au-delà de l’influence des FGF sécrétés par l’AER. Chez le poulet, FGF2, FGF4 ou FGF8 sont suffisants pour sauver l’expression de SHH en l’absence d’AER. Lhx2 est l’intermédiaire activé par les FGF et qui contrôle l’expression de SHH.

La boucle de régulation de maintien mutuel entre les FGF et Shh se termine lorsque le facteur de transcription Tbx2 inhibe l’expression de Gremlin (Farin et al., 2013).

**Tbx2 réprime directement l’expression de Grem1 dans le mésenchyme postérieur des bourgeons de membre matures.
(A–F) Analyse en hybridation in situ de l’expression de Tbx2 et de Grem1 dans les membres postérieurs d’embryons à E12.0 et E11.5 sauvages ou Tbx2−/−. Les flèches (C, F) indiquent l’expansion postérieure de l’expression de Grem1 dans les bourgeons Tbx2−/−. Des lignes pointillées blanches délimitent la limite antérieure de l’expression de Tbx2. (G–I) Analyse comparative de l’expression de cre, contrôlée par les régions régulatrices de Tbx2, et de Grem1 par hybridation in situ sur des sections sagittales adjacentes des membres postérieurs d’embryons E11.5 Tbx2cre/+ (contrôle) et Tbx2cre/cre (mutant). Les plans de coupe sont indiqués par des lignes noires en E et F. Les pointes de flèches marquent la limite antérieure de l’expression cre (en vert) et la limite postérieure de l’expression Grem1 (en rose). Les superpositions de fausse couleur dans (I) montrent l’expansion postérieure de Grem1 dans les membres postérieurs de Tbx2−/−. (J–K) Analyse en ChIP (immunoprécipitation de la chromatine) utilisant la chromatine des moitiés antérieure ou postérieure des membres postérieurs de type sauvage E11.5. Le schéma (J) montre l’expression de Tbx2 (bleu) exclusivement dans la moitié postérieure du membre. (K) Détection par ChIP-PCR des régions d’ADN liées à Tbx2. L’ADN génomique total a été utilisé comme témoin positif. Dans les moitiés postérieures des membres, Tbx2 se lie à l’enhancer qui contrôle l’expression dans le membre de Grem1 mais pas aux autres régions de contrôle génomique. Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1003467

Les cibles de la voie Shh dans le membre ont été identifiées d’une part à partir d’une analyse à l’échelle du génome des sites de liaison directs de Gli3 dans les bourgeons de membre de souris par ChIP avec un transgène Gli3 marqué avec un tag (Vokes et al., 2008) et d’autre part à partir de plusieurs analyses d’expression génique à la suite d’activations et inhibitions de la voie Shh (Lewandowski et al., 2015, McGlinn et al., 2005, Probst et al., 2011). L’identification des sites de liaison des Gli in vivo a révélé plus de 200 gènes cibles avec des séquence de liaison aux Gli (GBR) ainsi qu’un ensemble de cibles tout aussi large dépourvu de GBS, qui restent moins bien caractérisés (Vokes et al., 2008). La majorité des gènes cibles de GBS+ qui sont exprimés dans un domaine postérieur sensible à Shh sont régulés principalement par la dé-répression (c’est-à-dire la libération de Gli3R du site).

Les cibles Shh comprennent trois classes fonctionnelles principales : 1) les cibles impliquées dans la « configuration » qui fournissent directement des informations de position conduisant à des identités spécifiques et/ou à des relais d’indices de position (par exemple, les zones AP) vers d’autres signaux en aval ; et 2) des cibles jouant un rôle dans l’expansion des bourgeons des membres – qui comprend à la fois des cibles directes agissant dans le mésoderme et des relais vers l’ectoderme pour moduler la fonction de l’AER et de ses FGF. Un troisième groupe est constitué de cibles directes impliquées dans la transduction ou la régulation de la voie Hh elle-même, contribuant à de vastes circuits de rétroaction interconnectés et, encore une fois, ajoutant à la complexité de l’analyse fonctionnelle de la voie dans le membre. La régulation croisée et de rétroaction élaborée entre Shh lui-même, l’expression de Gli3 et les cibles « en aval » a rendu difficile la séparation nette des contributions fonctionnelles des différentes entrées. Ces cibles incluent plusieurs régulateurs de l’expression de Shh tels que Prdm1 (Robertson et al., 2007).

**Les membres antérieurs déficients en Prdm1 ne parviennent pas à maintenir la ZPA. Comparaison des bourgeons de membres antérieurs (FL) et postérieurs (HL) de type sauvage (A,C,E,G,I,K,M,O,Q) et mutant (B,D,F,H,J,L,N,P,R) en hybridation in situ. (A-C) L’activation de l’expression de Shh, un marqueur de la ZPA, se déroule normalement à E10,5 dans les bourgeons des membres postérieurs sans Prdm1, mais est nettement réduite dans le bourgeon des membres antérieurs (B). En E11,5, l’expression de Shh est confinée à une petite parcelle de mésenchyme distal dans les membres antérieurs mutants (D). (H) Les membres mutants sans Prdm1 expriment Fgf4 dans l’AER en formation à E10.5. En revanche, par E12.5, Fgf8 est absent du membre proximal postérieur mutant (J), en raison de la perte de l’AER et du mésenchyme sous-jacent. L’expression Lmx1 montre une structuration D-V normale dans le membre antérieur (K,L). L’étude de l’expression de Tbx2 (N) et de Gli1 (P) dans les bourgeons des membres antérieurs déficients en Prdm1 mettent en évidence la perte rapide de tissu postérieur. Grem1 (Gremlin) est exprimé dans les bourgeons des membres mutants bien qu’à des niveaux inférieurs (R). Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7116377/#!po=20.5000

Parmi les cibles potentiellement régulatrices de l’identité des doigts, les gènes 5’Hoxd et Hoxa ont été les plus fortement impliqués sur la base des phénotypes des mutants simples et composés (Davis et Capecchi, 1996, Zakany et al., 1997). Cependant, il n’y a pas de « code Hox » ; leurs cibles sont encore mal comprises et les mécanismes par lesquels ils transmettent des indices de position précoces restent peu caractérisés.

Polarité dorso-ventrale du bourgeon de membre

La polarité dorso-ventrale correspond par exemple à la différence entre le dos et la paume de la main. C’est l’ectoderme qui contrôle l’identité dorso-ventrale du mésenchyme mésodermique du bourgeon de membre car si, avec des excisions et des greffes, on inverse les positions de l’ectoderme dorsal et de l’ectoderme ventral, l’ensemble du membre aura une polarité inversée. Cela amène à penser qu’un signal inducteur est envoyé de l’ectoderme au mésoderme sous-jacent. Ce signal inducteur a été identifié comme Wnt7a et il est sécrété par les cellules de l’ectoderme dorsal (et pas les cellules de l’ectoderme ventral). Il induit l’expression du facteur de transcription Lmx1b dans le mésoderme dorsal.

Les souris knock-out Lmx1b-/- présentent des membres avec uniquement des structures ventrales. Des patients avec des mutations perte-de-fonction de LMX1B n’ont pas d’ongle à leurs doigts et pas de rotule à leur genoux (ongles et rotules sont typiquement des structures dorsales).

Les structures ventrales ne sont cependant pas produites par défaut. Elles nécessitent l’expression de Engrailed-1 dans l’ectoderme ventral. Cette expression est induite par des BMP en provenance du mésenchyme mésodermique.

*La régionalisation dorsoventrale du bourgeon de membre est altérée par la perte ou le gain de fonction de BMP. Des coupes présentent (A-C) un bourgeon de membre (bdm) contrôle de stade 20 (D-G) un bdm de même stade infecté par des rétrovirus permettant d’exprimer Noggin et (H-K) un bdm infecté avec un rétrovirus permettant d’exprimer BmpRIB activé de manière constitutive. La surexpression de Noggin entraîne des membres dorsalisés en raison de la perte d’EN1 et de l’expression ectopique de Wnt7a et Lmx1 sur la face ventrale (marquée par des astérisques dans D-F), tandis que la surexpression de BmpRIB constitutivement activé ventralise le membre en raison de l’expression ectopique de EN1 et de l’inhibition de l’expression de Wnt7a et de Lmx1 sur le côté dorsal (marqué par + dans H-J). A noter qu’en H-K, il n’y a pas d’AER morphologique. (G, K) Anticorps anti-GAG pour révéler la distribution du rétrovirus. (L-M) Double hybridation in situ pour Fgf8 dans l’AER et Shh dans le mésenchyme. (L) Contrôle, (M) bdm infecté surexprimant Noggin, (N) bdm infecté surexprimant Lmx1. La ligne blanche marque la ligne médiane de l’AER et de l’interface DV. Après la dorsalisation des membres due à une surexpression de Noggin ou Lmx1, l’expression de Shh est élargie ventralement. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/128/22/4463/41557/BMP-controls-proximodistal-outgrowth-via-induction

Comme nous l’avons vu avec la coordination entre le développement de l’axe proximo-distal et antéro-postérieur, l’axe dorso-ventral ne se met pas en place de manière isolée. Par exemple, l’absence de Wnt7a aboutit non seulement à des membres ventralisés mais aussi à un manque de doigts postérieurs. Cela vient du fait que Wnt7a participe au maintien de l’expression de Shh dans la ZPA en synergie avec FGF4 venant de l’AER.

Contrôle de l’apoptose interdigitale

L’apoptose dans le mésenchyme interdigital est indispensable à la morphogenèse des doigts. Elle est induite par les BMP.

*Les BMP sont nécessaires à l’apoptose interdigitale. Coloration à l’acridine orange (points jaunes) d’extrémités de bourgeons de membre postérieur d’embryons de souris à E15.5 sauvages (E, G) ou avec une délétion conditionnelle des gènes codant BMP2 et BMP4 Bmp2C/C;Bmp4C/C;Prx1::cre (F, H). Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.0020216

Les doigts sont protégés de l’action des BMP par l’expression de Noggin.

Dans la future aile de la chauve-souris ainsi que dans la future patte postérieure de canard, on n’observe pas d’apoptose contrairement aux futures pattes de la souris ou du poulet. Les mécanismes moléculaires de ces différences ont été étudiés. Dans la zone interdigitale de la future aile de la chauve-souris ainsi que de la future patte postérieure de canard, un ligand Gremlin est produit et inhibe l’action des BMP. Dans la future aile de la chauve-souris des ligands FGF agissent en complément pour maintenir en vie les cellules de la zone interdigitale et en plus activer leur prolifération ce qui permet de créer la grande surface portante interdigitale.

La régénération des bourgeons de membre

Les membres d’axolotl sont composés de nombreux types de cellules différentes provenant de lignées neurales, myogéniques, épidermiques et de tissu conjonctif. Lors de l’amputation d’un membre, les cellules situées à proximité du plan d’amputation (jusqu’à 1 mm de profondeur) s’accumulent dans un tissu distinctif appelé blastème, qui sert de source de cellules progénitrices pour construire le nouveau membre.

*Coupes proximo-distales de membres d’axolotl en régénération, 10, 20 ou 30 jours après l’amputation colorées avec de l’hématoxyline/éosine (colorants histologiques généraux) et du bleu alcian (colore les cartilages en bleu). L’os du moignon est indiqué (stump bone). La ligne noire correspond à la ligne où a été réalisée l’amputation. On voit qu’à 10 jours, le blastème s’est mis en place et qu’à 20 jours, la croissance du cartilage est bien entamée. Barre d’échelle = 1 mm. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0133375

La source des cellules est locale. Si, par une irradiation aux rayons X, on détruit les cellules juste derrière la cicatrice, le membre ne régénère pas alors qu’il régénère si on irradie des cellules plus éloignées.

Les souches d’axolotl transgéniques dans lesquelles les descendants de types cellulaires adultes distincts peuvent être marqués, suivis et isolés au cours du processus de régénération permettent de comprendre comment des lignées cellulaires particulières se développent pendant la formation du blastème et la régénération ultérieure des membres. La combinaison de ces souches d’axolotl transgéniques avec le séquençage d’ARN en cellules isolées (scRNA-seq) permet le suivi de types cellulaires individuels, ainsi que la reconstruction des étapes moléculaires. Les cellules du tissu conjonctif, descendantes du mésoderme des lames latérales, sont la lignée la plus abondante contribuant au blastème et régénèrent les os et le cartilage, les tendons, le périsquelette et les fibroblastes dermiques et interstitiels. Les restrictions de lignage sont plus marquées pour les autres cas : les nouvelles cellules musculaires proviennent seulement de cellules musculaires, les nouvelles cellules de Schwann proviennent uniquement des cellules de Schwann et ainsi de suite.

Le manchon épidermique qui recouvre le blastème produit du FGF qui est essentiel pour la prolifération des cellules du blastème, ce qui rappelle les fonctions de l’AER avec le mésenchyme sous-jacent durant le développement normal. On retrouve également l’expression de Shh dans la région postérieure. Les gènes Hox sont aussi activés précocement avec Hoxa9 et Hoxa13 exprimés dans tout le blastème puis progressivement l’expression caractéristique « en nid » des gènes Hox se met en place comme lors du développement normal.

Chez les mammifères, les capacités de régénération sont très modestes comparées à l’axolotl et limitées au tiers distal du troisième segment phalangien (l’élément terminal). Cette réponse régénérative est spécifique du niveau d’amputation : l’amputation du tiers distal du segment phalangien terminal peut se régénérer, alors qu’une amputation du segment phalangien moyen forme seulement un cal hypertrophique de l’os (Han et al., 2008).

*Régénération de la partie distale de la dernière phalange chez la souris. A gauche, on observe la dernière phalange avant amputation. L’amputation se fait au jour 0 (D0) et on suit la régénération jusqu’au jour 42 (D42). Coloration histologique trichrome Masson. Source : https://elifesciences.org/articles/71542

Aspects Evo/Dévo

La transition nageoire-membre est une étude de cas classique de l’évolution morphologique. Cette évolution a eu lieu au Dévonien parmi un groupe de Sarcoptérygiens (qui ont des muscles dans leurs nageoires paires contrairement au Actinoptérygiens) à partir des nageoires paires (pectorales pour les membres antérieurs et pelviennes pour les membres postérieurs). Les membres de Tétrapodes ont d’abord évolué dans des organismes exclusivement aquatiques et ce n’est qu’après qu’ils ont permis la sortie de l’eau par exaptation.

Nous avons vu que les membres des Tétrapodes sont composés de trois modules : le stylopode, le zeugopode et l’autopode, qui sont ordonnés de manière proximale à distale. En revanche, les nageoires de poisson sont souvent subdivisées en différents modules anatomiques le long de l’axe antéro-postérieur : le propterygium, le mesopterygium et le métaptérygium. L’autopode (poignet et doigts) semble être la nouveauté morphologique la plus apparente au cours de la transition nageoire-membre (Clack, 2009), bien que cette différence ait été exagérée par le passé en se concentrant sur le poisson-zèbre, un organisme modèle qui a des nageoires assez modifiées par rapport à la situation ancestrale. Plusieurs études ont en effet révélé que la régulation spécifique de Hoxa13 et Hoxd10-13, qui contrôlent la formation des autopodes, est également conservée chez les vertébrés non tétrapodes (Tanaka et al., 2016; Freitas et al., 2007; Gehrke et al. 2014), sauf que les domaines d’expression de Hoxa13 et Hoxa11 s’excluent mutuellement dans les membres de souris et de poulet tout en se chevauchant dans les bourgeons de nageoires de poisson examinés.

**Des enhancers contrôlant l’expression des gènes HoxA et HoxD 5′ chez un poisson activent l’expression d’un gène rapporteur dans l’autopode chez la souris. Des souris transgéniques sont produites où divers enhancers contrôlant l’expression des gènes HoxD 5′ (Island I, CsB) ou des gènes HoxA 5′ (e16) d’un Lepisostéidé (bar) ou du poisson-zèbre contrôlent l’expression du gène rapporteur LacZ. On constate que ces éléments sont actifs dans l’autopode de souris pour les 3 éléments provenant du Lepisostéidé avec des patrons qui rappellent les gènes HoxA/D de la souris. En revanche, l’orthologue Island 1 en provenance du poisson zèbre n’est pas activé, ce qui montre que des structures homologues à l’autopode existent chez les poissons mais que le poisson-zèbre les a perdus. Source : https://www.pnas.org/content/pnas/112/3/803.full.pdf

Bien que plusieurs différences de régulation des gènes aient été proposées pour expliquer la différence anatomique entre les nageoires et les membres, ces propositions ont été exclusivement axées sur les gènes Hox (Kherdjemil et al., 2016; Nakamura et al., 2016; Sheth et al., 2012) et il y a sans doute beaucoup de choses intéressantes à découvrir avec l’étude des autres gènes impliqués.

VOIR LES EXERCICES SUR LE DEVELOPPEMENT DES BOURGEONS DE MEMBRES

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