Les cellules des crêtes neurales

Le squelette cranio-facial

**Morphogenèse de la face d’un embryon de poulet. Reconstructions 3D à partir de mesures prises sur des embryons. La période ici est équivalente à la 6-7^ème semaine de développement chez l’humain. e = œil; fnm = masse fronto-nasale; md = proéminence mandibulaire; mxp = proéminence maxillaire; np = fosses nasales. Barre d’échelle = 500 µm. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/148/9/dev193755/237764/Symmetry-and-fluctuation-of-cell-movements-in

Le façonnement de la forme de la tête et de ses composants est un apport essentiel des CCN au développement des Vertébrés par rapport aux Cordés non vertébrés qui n’ont pas de véritables CCN. Le développement de la mâchoire et donc de la prédation au sein des Vertébrés est un apport évolutif fonctionnel majeur dû aux crêtes neurales (Northcutt, 2005). Les CCN contribuent essentiellement au squelette cranio-facial ventral. Dans la partie dorsal, le mésoderme céphalique forme quelques pièces squelettiques.

*Faisceaux de migration des CCN dans la tête d’Ambystoma mexicanum (axolotl). Le faisceau de migration de la crête neurale mandibulaire (MNC) est divisé en deux et entoure la vésicule optique (OV). Le faisceau de la crête neurale hyoïdienne (HNC), situé en avant de la vésicule otique (O), a migré le plus ventralement de tous les faisceaux. Deux faisceaux branchiaux (BNC) sont visibles en postérieurement à la vésicule otique. Les cellules de la crête neurale commencent à se disperser de leurs faisceaux respectifs vers le mésoderme adjacent. Le côté antérieur est vers la droite. Barre d’échelle = 0,2 mm. Source.

**Migration des CCN céphaliques et contribution au squelette cranio-facial. Pendant l’embryogenèse, le cerveau est divisé en 3 vésicules : prosencéphale (subdivisé ensuite en télencéphale et en diencéphale), mésencéphale et rhombencéphale (subdivisé en rhombomères puis ensuite en métencéphale et myélencéphale). Les couleurs mettent en évidence les régions du visage en développement qui correspondent à des populations de CCN d’origines axiales différentes. La proéminence faciale et les arcs pharyngés subissent ensuite une morphogenèse complexe pour former les structures de la face. Les structures squelettiques laissées en gris proviennent du mésoderme céphalique. AS, os alisphénoïde, F, os frontal, FEZ, zone ectodermique frontonasale, FNP, proéminence frontonasale, H, os hyoïde, I/S, marteau et enclume (2 des 3 osselets de l’oreille moyenne), M, mandibule, MX, maxillaire, N, os nasal, PA, arcades pharyngiennes, r, rhombomère, S, squamosal, Z, os zygomatique. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.644410/full

***Exemple de contribution des CCN et du mésoderme paraxial céphalique au crâne chez la souris. Les cellules de crêtes neurales donnent naissance à l’os frontal tandis que le mésoderme paraxial céphalique donne naissance à l’os pariétal. Entre les deux os, se met en place la suture coronale. Source : https://www.mdpi.com/2221-3759/8/3/18/htm

Les CCN qui contribuent au squelette cranio-facial colonisent le premier arc pharyngien (ou branchial) et le processus frontonasal. Les marquages par greffe caille-poulet ont permis de montrer que les CCN qui migrent du diencéphale postérieur se retrouvent dans le bourgeon naso-frontal, les CCN qui migrent du mésencéphale antérieur se retrouvent dans le processus maxillaire et dans la région rétro-oculaire, les CCN qui migrent du mésencéphale postérieur et des 2 premiers rhombomères se retrouvent dans l’arc mandibulaire (Couly et al., 1996). Les CCN qui migrent à partir du rhombomère 4 forment l’arc hyoïde (l’arc pharyngien 2) et des neurones du ganglion crânien facial VII.

*Migration segmentée des CCN céphaliques et signaux qui la contrôlent. Migration segmentaire des CCN céphaliques dans un embryon de vertébré. Les flèches jaunes représentent les flux de migration des CCN diencéphaliques (di-), mésencéphaliques antérieures et postérieures (mes-), et rhombencéphaliques vers le processus frontonasal (FNP) et les arcs pharyngés 1-4 (PA1-4). Les CCN migrent en trois flux individuels vers les arcs pharyngiens : S1, S2 et S3. Les CCN provenant du mésencéphale postérieur, du rhombomère 1 (r1) et du r2 remplissent le premier arc pharyngé (PA1), tandis que les NCC provenant du r4 remplissent le deuxième arc pharyngé (PA2). Dans le cerveau postérieur post-otique, les CCN de la région r6-r8 colonisent indifféremment PA3-6, PA3 étant principalement formés par les CCN de r6. Certains des mécanismes moléculaires impliqués dans l’établissement et le maintien de la migration des flux de CCN sont également présentés. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/137/16/2605/43879/Molecular-mechanisms-of-cranial-neural-crest-cell

Chez les Mammifères, les trois osselets de l’oreille moyenne (marteau, enclume, étrier) sont évolutivement issus des arcs pharyngiens et donc des CCN céphaliques. Ce sont des signaux provenant de l’endoderme adjacent (Shh et BMP4) qui contrôlent leur spécification et leur différenciation (Ankamreddy et al., 2019).

Durant leur migration, les CCN céphaliques doivent aussi proliférer pour coloniser de vastes territoires.

**Taille, forme et distribution des clones de CCN céphaliques.
Traçage génétique des cellules de la crête neurale et de leurs descendances clonales induites à E8.5 dans des embryons Sox10-CreERT2/R26Confetti et analysées à E9.5 à E10. (A) Tête de l’embryon E10 avec un seul clone YFP+. Notez la structure compacte du clone. (B) Plusieurs clones séparés dans différentes régions du visage de l’embryon. Les pointes de flèches jaunes et bleues indiquent l’orientation de migration des groupes cellulaires. (C) Exemple de plusieurs clones qui se chevauchent dans le visage en développement précoce. Source : https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.1600060

Les CCN céphaliques doivent acquérir une information de position pour migrer correctement et se différencier en structures adéquates. Elles sont régionalisées entre autres par les gènes Hox. Les CCN les plus antérieures jusqu’au rhombomère 2 inclus n’expriment pas de gène Hox tandis que les CCN plus postérieures en expriment. Cela a un impact sur leur détermination. Seules les CCN qui n’expriment pas les gènes Hox peuvent donner du tissu osseux (Creuzet et al., 2005). Si on force l’expression de gènes Hox dans les CCN les plus antérieures, elles perdent leur capacité à former du tissu osseux.

La migration en flux bien distincts et définis, sans mélange, entre les différents niveaux de l’axe AP permet de préserver ces identités spécifiques des CCN et de les « transporter avec elles » vers leurs tissus de destination. Cependant, ces derniers peuvent dans une certaine mesure influencer le devenir des cellules et des régions du mésoderme céphalique peuvent induire des destinées nouvelles dans des CCN greffées ectopiquement, surtout si celles-ci sont en petit nombre (Trainor et Krumauf, 2000). Il y a ainsi mise en évidence d’un effet de communauté où de grandes populations de CCN ont une plasticité moindre que des petites populations isolées où la détermination n’est pas aussi fermement établie.

Un code impliquant une combinaison des gènes Dlx permet de spécifier les structures dérivées des CCN du premier arc branchial : Dlx1 et Dlx2 sont exprimés dans les processus mandibulaire et maxillaire, Dlx5 et Dlx6 uniquement dans le processus mandibulaire et Dlx3 et Dlx4 que dans la région la plus distale du processus mandibulaire (Minoux et Rijli, 2010). Les gènes Dlx codent des facteurs de transcription à homéodomaine, comme les gènes Hox.

*Un code Hox combiné à un code Dlx spécifie l’identité positionnelle des CCN céphaliques. Les schémas correspondent à des têtes d’embryon de souris à E10.5. (A) Le code Hox confère une identité spatiale (identité inter-arche) le long de l’axe AP (antéro-postérieur) aux CCN céphaliques colonisant les arcs pharyngés (PA). Chaque arc pharyngé est représenté par une couleur différente représentant son code d’expression Hox spécifique. PA1 est dépourvu d’expression de gènes Hox. Chez la souris, l’expression de Hoxb2 est inhibée dans les CCN post-migratoires de PA2, et Hoxb3 et Hoxd3 ne sont que faiblement exprimés dans PA3. (B) Le code Dlx fournit une identité spatiale (identité intra-arche) aux CCN céphaliques le long de l’axe DV (dorsoventral, proximodistal) des arcs pharyngés. md, processus mandibulaire de PA1 ; mx, processus maxillaire de PA1. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/137/16/2605/43879/Molecular-mechanisms-of-cranial-neural-crest-cell

Les facteurs de transcription de type hélice-boucle-hélice basique Hand1 et Hand2 jouent un rôle essentiel dans le développement des crêtes neurales céphaliques. La délétion spécifique de Hand2 dans les CCN aboutit à la quasi-disparition de la mâchoire inférieure et de la langue (Barron et al., 2011). Un phénotype important des mutations perte-de-fonction de Hand1 n’apparait que si on les met dans un contexte hétérozygote pour Hand2, montrant une compensation fonctionnelle partielle (Barbosa et al., 2007). Non seulement, l’expression de ces facteurs de transcription est importante mais aussi leur phosphorylation sur des sérines/thréonines (Firulli et al., 2014). Des formes déphosphorylées favorisent les formations d’homodimères alors que les formes phosphorylées favorisent les formations d’hétérodimères (comme Hand1/Hand2 par exemple) et les cibles génétiques activées entre ces deux formes ne sont pas les mêmes.

***L’état de phosphorylation de Hand1 est important pour la morphogenèse cranio-faciale. Images en microtomographie des crânes de souris P0 sauvages et mutantes. Les allèles codant la thréonine 107 et la sérine 109 de Hand1 ont été remplacés soit par des alanines, un acide aminé non phosphorylable (PO4−) ou par des acides aspartiques, un acide aminé qui mime une phosphorylation par sa charge négative (PO4+) . L’allèle fx correspond à une totale perte de fonction. Vue latérale droite (K), dorsale (L) et ventrale (M) des crânes. Abréviations pour la ligne K : i, os interpariétal (turquoise); p, os pariétal (vert clair); f, os frontal (rouge); n, os nasal (vert); carré, os squamosal (violet clair) ; pm, prémaxillaire (violet foncé); j, os jugal (rouge foncé); mx, maxillaire (bleu) ; md, mandibule (bronze); ty, os tympanique (non coloré). Abréviation de la ligne L : i, incisives (magenta, indiquées par une flèche blanche). Abréviations pour la ligne M : pl, os palatins (jaune); bs, phenoïde (non coloré); pt, os ptérygoïdes (non colorés). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/141/15/3050/46274/Hand1-phosphoregulation-within-the-distal-arch

Les mutations du facteur de transcription TWIST1 chez l’homme sont associées à la craniosynostose (El Ghouzzi et al., 2000) et à des anomalies vasculaires cérébrales (Tischfield et al., 2017). La craniosynostose est la fusion prématurée des sutures crâniales. Elle concerne 1 naissance sur 2000. Les mutations perte-de-fonction de TWIST1 constituent la deuxième cause de craniosynostose et prennent phénotypiquement la forme du syndrome de Saethre-Chotzen.

***Suivi temporel de la fermeture de la suture coronale chez les souris Twist1+/−, un modèle du syndrome de Saethre-Chotzen. Au jour p11, la coloration au pentachrome révèle la présence de cartilage (coloration en bleu) entre les plaques osseuses de la suture COR des souris Twist1^+/-, alors qu’aucun cartilage n’est présent chez les souris de type sauvage. Au jour p13, la fermeture pathologique de la suture COR est observée chez les souris Twist1^+/-. Les lignes pointillées indiquent les plaques osseuses. Barre d’échelle : 50 µm. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2011.00037/full

Les analyses phénotypiques de la souris knock-out conditionnelle Twist1 ont révélé que TWIST1 est nécessaire dans les CCN pour la formation du squelette facial, la voûte crânienne antérieure et la structuration des nerfs crâniens (Soo et al., 2002; Ota et al., 2004; Bildsoe et al., 2009; Bildsoe et al., 2016).

Twist1 a été impliqué dans l’activation de la migration des CCN. Il active l’expression de gènes nécessaires à cette migration en recrutant notamment des modificateurs de la chromatine tels que les hélicases à chromodomaine Chd7 et Ched8 ainsi que l’histone-méthyltransférase Whsc1 (Fan et al., 2021).

**Rôle de Twist1 et de ses interactants lors de tests de migration d’un modèle de CCN. Des cellules neuroépithéliales provenant de souris sauvages ou mutées sont cultivées en agrégat dans des conditions où habituellement certaines cellules de ces agrégats se mettent à migrer sur le substrat : ces cellules expriment des marqueurs des CCN. On constate que l’absence d’un allèle fonctionnel de Twist1 (ce qui est le cas chez les patients atteints du syndrome de Saethre-Chotzen) altère fortement la migration des cellules et que cet effet est renforcé en combinant cette mutation avec les mutations de ses interactants qui modifient la chromatine (Chd7, Chd8 et Whsc1). Des mutations perte-de-fonction dans le gène codant Chd7 provoquent le syndrome CHARGE où le développement de nombreux tissus (dont certains dérivés des CCN) est affecté. Source : https://elifesciences.org/articles/62873

Le développement des CCN céphaliques est bien sûr influencé par des molécules de signalisation produites dans leur environnement. Par exemple, Sonic Hedgehog (Shh) est exprimé dans la zone épidermique fronto-nasale (FEZ) et il contrôle notamment la prolifération. Une inhibition de l’action de Shh aboutit à une figure étroite et tronquée alors qu’une suractivation de la voie de signalisation Shh produit une mâchoire supérieure très large (Hu et Marcucio, 2009).

**Courbe dose-réponse de la taille du milieu de la face en fonction de l’activité de la voie de signalisation Shh. On greffe dans la région céphalique frontale d’embryons de poulet des billes diffusant différentes doses de Shh (Shh-N) ce qui active plus ou moins la voie de signalisation Shh ou on injecte différentes concentrations de cellules produisant des anticorps monoclonaux 5E1 anti-Shh qui diminuent plus ou moins l’activité de cette voie de signalisation. Après 72 heures, on fixe les embryons et la morphologie de leur face est numérisée et mesurée. En ordonnées, PC1 est un mélange normalisé de plusieurs valeurs de distance entre différents points de la face. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/137/20/3405/43926/Quantitative-analyses-link-modulation-of-sonic

Shh a été directement impliqué dans le développement de la lèvre supérieure et du palais, ce qui en fait une des voies de signalisation qui peut être perturbée en présence d’une fente labiale et d’une fente palatine (« bec-de-lièvre ») (1 naissance sur 1000 environ).

*Shh et la morphogénèse de la lèvre supérieure et du palais. (A) La formation de la lèvre supérieure (panneaux supérieurs) et du palais secondaire (panneaux inférieurs) se produit par excroissance et fusion du processus nasal médian (MNP) et du processus maxillaire (MXP). Ces tissus sont constitués d’un mésenchyme dense recouvert d’épithélium ectodermique. (B) Shh est produit dans l’ectoderme épithélial et agit sur les cellules mésenchymateuses sous-jacentes (dérivées des CCN). Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.621442/full

Une activité de signalisation Wnt altérée est fortement associée à la présence d’une fente palatine. Par exemple, Wnt5a est exprimé dans le mésenchyme dérivé des CCN et les souris dépourvues de Wnt5a ou de son récepteur Ror2 ont une mandibule raccourcie et une fente palatine (He et al., 2008). De plus, une déficience mésenchymateuse de Porcn, codant pour une O-acyltransférase nécessaire à la modification lipidique des WNT, entraîne également une fente palatine (Bankhead et al., 2015).

Les facteurs BMP interviennent également. Une déficience en BMP4 entraîne des anomalies cranio-faciales, telles qu’une fente labiale et palatine, chez la souris comme chez l’homme (Liu et al., 2005; Suzuki et al., 2009). BMP4 régule la configuration proximodistale et le moment de la différenciation osseuse dans le mésenchyme mandibulaire (Liu et al., 2005; Merrill et al., 2008). Par exemple, l’une des cibles directes de la voie BMP est le gène Satb2 codant un facteur important pour le développement des ostéoblastes. Le gène Hand1 est également une des cibles directes (nous avons vu l’importance de ce gène plus haut) (Bonilla-Claudio et al., 2012). Des changements dans la signalisation BMP4 jouent un rôle significatif dans l’évolution comme le montre l’exemple des pinsons de Darwin (Abzhanov et al., 2004; Wu et al., 2004) ou celui des poissons cichlidés (Albertson et al., 2005).

Des facteurs environnementaux tératogènes peuvent affecter le développement des CCN céphaliques. Le plus répandu d’entre eux est l’alcool (l’éthanol) qui cause le syndrome d’alcoolisation fœtale qui touche environ 0,5 % des nouveaux nés et s’accompagne de déficiences mentales et de malformations craniofaciales (milieu de la figure plus aplati, nez plus petit, philtrum (sillon entre l’axe du nez et la lèvre supérieure) réduit…) Ces malformations ont été reliées à des défauts de survie d’une fraction des CCN céphaliques.

**Mécanismes reliant un excès d’éthanol avec la mort cellulaire d’une fraction de CCN céphaliques. FA = acide folique. Source : https://www.mdpi.com/2076-3425/3/2/964

Des mutations dans le gène Vangl2 dont le produit est impliqué dans la voie de polarité planaire Wnt rendent plus sensibles à l’alccol un modèle de poisson-zèbre de syndrome d’alcoolisation foetale, montrant les interactions entre facteurs génétiques et facteurs environnementaux (Sidik et al., 2021).

Egalement, une partie d’une des anomalies congénitales les plus fréquentes, la présence d’une fente labiale et d’une fente palatine (« bec-de-lièvre ») (1 naissance sur 1000 environ) est causée par l’exposition à des facteurs tératogènes environnementaux (alcool, fumée de cigarette, dioxine, déxaméthasone, métaux lourds) (Buser et Pohl, 2015; Carlson et al., 2022). Des mutations sont aussi associées avec ce phénotype (au moins une cinquantaine de loci ont été impliqués) et des interactions complexes environnement/génotype sont à l’origine de ce type d’anomalies (Beaty et al., 2016).

*Enfant avec une fente labiale (et palatine, mais non visible sur ce cliché). Source : https://fr.m.wikipedia.org/wiki/Fichier:Cleftlipandpalate.JPG

Lors de la formation des dents, les cellules des crêtes neurales (CCN), interagissent avec l’épithélium oral compétent des placodes dentaires. Cette interaction initie la formation de la lame dentaire, puis du bourgeon épithélial, et conditionne la condensation mésenchymateuse qui donnera les odontoblastes sécréteurs de dentine ainsi que les cellules de la papille dentaire. Des expériences classiques, comme celles de Lumsden en 1984 sur des recombinaisons ex vivo chez la souris, démontrent que seules les CCN associées à l’épithélium oral spécifique permettent le développement d’un germe dentaire fonctionnel.

**Marquage des cellules de crêtes neurales dans le mésenchyme dentaire d’une molaire de souris à E13,5. (b, c, e) Cartographie par analyse de transcriptome unicellulaire des cellules du mésenchyme dentaire, montrant l’expression de Tfap2b (c, en rose) et de Lhx6 (e, en rose) dans une sous‑population mésenchymateuse. (d, f) Hybridation in situ fluorescente sur coupes frontales de germe dentaire mettant en évidence l’expression de Tfap2b (d, magenta) et de Lhx6 (f, magenta) autour du bourgeon épithélial (contours pointillés), au sein du mésenchyme dentaire dérivé des crêtes neurales (flèches blanches). (g) Schéma récapitulatif de la localisation des cellules Tfap2b+/Lhx6+ (cercles roses) dans le mésenchyme dentaire entourant le bourgeon molaire à E13,5. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-022-32490-y

Différenciation in vitro des cellules de crêtes neurales à partir de cellules pluripotentes humaines

Les neurocristopathies sont des maladies liées à des défauts de développement des crêtes neurales. Pour mieux comprendre l’enchaînement des évènements qui mènent de la ou des mutation(s) jusqu’à la malformation, la culture de cellules de crêtes neurales humaines in vitro est un grand atout. De nombreuses équipes ont mis au point divers protocoles pour produire des CCN à partir de cellules ES ou de cellules iPS humaines. Les protocoles sont inspirés de l’enchaînement de l’activation des voies de signalisation dans l’embryon. Les CCN sont obtenus avec une activation modérée de la voie BMP (mimant ce qu’il se passe dans la bordure neurale) et la voie WNT doit être activée. Il s’agit non seulement d’obtenir des CCN mais aussi des CCN du bon niveau antéro-postérieur (céphalique, vagal, troncal…). L’activation de la voie de signalisation FGF est utilisée pour postérioriser des CCN qui, par défaut dans les protocoles utilisés, sont plutôt céphalique. Cette même modulation peut être obtenue dans d’autres protocoles avec un renforcement de la voie WNT. L’acide rétinoïque peut également être utilisé pour postérioriser des CCN et obtenir des CCN vagales et cardiaques.

**Régionalisation antéro-postérieure de CCN obtenues in vitro à partir de cellules ES ou iPS humaines. Des traitements sont appliqués avec une activation modérée de la voie BMP et une activation de la voie Wnt. On obtient des CCN céphaliques. L’application d’acide rétinoïque (RA) permet d’obtenir des CCN vagales/cardiaques. Un traitement avec du FGF permet d’obtenir des CCN troncales. A droite, sont représentés les différents gènes Hox activés au cours des protocoles et leur position sur l’axe antéro-postérieur avec un code couleur qui indique leur expression dans les dérivés obtenus à partir des cellules ES et iPS. Source : https://elifesciences.org/articles/35786

LIEN VERS LE GLOSSAIRE

DES EQUIPES FRANCOPHONES TRAVAILLANT SUR LE SUJET :

Equipe « Destin, plasticité et reprogrammation cellulaire » – Institut Cochin, Paris