L’autophagie

Par Patrick Pla, Université Paris-Saclay

L’autophagie représente une voie de dégradation de composants cellulaires par les lysosomes (ou les vacuoles chez les cellules végétales). C’est un processus physiologique qui permet de se débarrasser de composants obsolètes ou défectueux et permet de recycler des molécules utiles. Elle est notamment déclenchée en période de pénurie de nourriture.

*Développement des phagosomes dans des feuilles de maïs carencées en azote. Des plants de maïs sont cultivés deux jours en hydroponique dans un milieu avec des quantités d’azote standard (+N) ou pauvre en azote (-N). Ces plants transgéniques expriment la protéine fusion YFP-ATG8a (YFP étant un fluorophore jaune et ATG8a étant une protéine que l’on trouve dans les autophagosomes, un compartiment qui englobe les éléments cellulaires à dégrader par autophagie). La carence en azote provoque le développement d’autophagosomes visibles comme des points à l’intérieur des cellules. Source : https://academic.oup.com/plcell/article/27/5/1389/6096473

*Autophagosomes dans la vacuole d’une cellule de tabac carencé en sucres. Vue en microscopie électronique à transmission. L’un des autophagosome contient une mitochondrie entière. AP = autophagosome. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1369526607000799

L’autophagie a été observée pour la première fois grâce aux progrès de la microscopie électronique dans les années 1950 et 1960 mais ce n’est qu’à partir des années 1990 que sa fonction et son mécanisme ont été compris. De l’autophagie a été décelée dans de très nombreuses circonstances. Par exemple, au cours de la fécondation chez les animaux, quelques mitochondries paternelles entrent dans le cytoplasme de l’ovocyte. Ces mitochondries sont éliminées par autophagie, ce qui assure l’exclusivité de l’origine maternelle des mitochondries d’un embryon (Sato et al., 2011). Autre cas, lorsque des cellules subissent des dommages à l’ADN conséquents, des fragments de chromosome sont expulsés du noyau et forment des micronoyaux. Ces micronoyaux sont éliminés par autophagie (dans ce cas, elle est appelée nucléophagie) (Mucino-Hernandez et al., 2023).

L’autophagie a également été observée comme un élément crucial du maintien des cellules souches et comme s’opposant au vieillissement chez l’hydre (Cnidaire) (Tomczyk et al., 2020).

Chez les végétaux, les plantes privées d’autophagie (mutants atg) sont très sensibles au manque de carbone et d’azote et présentent une sénescence précoce et une croissance réduite (Doelling et al. 2002; Li et al. 2015; Barros et al. 2017), ainsi que des retards dans la germination (Yoshimoto et al. 2014; Avin-Wittenberg et al. 2015).

Les protéines clés contrôlant l’autophagie sont codés par les Atg (pour autophagy-related genes), initialement découverts chez la levure, mais très conservés au cours de l’évolution. En inhibant l’expression des gènes Atg, on a pu étudier l’impact de l’autophagie sur diverses fonctions physiologiques de divers modèles cellulaires et d’organisme : l’adaptation à la carence en nutriments, le renouvellement des constituants cellulaires, la limitation du vieillissement, l’homéostasie des organites et la réponse immunitaire, ainsi que la relation entre l’autophagie et les maladies humaines telles que les maladies neurodégénératives, le diabète, le cancer et les infections.

Les matériaux cellulaires à dégrader par l’autophagie sont séquestrés dans des vésicules à double membrane appelées « autophagosomes » et transportés vers les lysosomes des cellules de mammifères ou les vacuoles chez les levures et les végétaux. Le matériel membranaire formant les autophagosomes proviennent de divers sources : membrane plasmique le plus souvent mais aussi endosomes de recyclage, appareil de Golgi, réticulum endoplasmique et même membrane externe mitochondriale (Ravikumar et al., 2010; Hailey et al., 2010). Ainsi, la production d’autophagosomes est liée à la dynamique des compartiments endomembranaires et notamment de l’endocytose dépendante de la clathrine.

*L’inhibition de l’endocytose médiée par la clathrine diminue la formation d’autophagosomes. Des cellules HeLa exprimant LC3 (un composant de la membrane des autophagosome) couplée à la GFP sont traitées avec des siARN contrôle (Control KD) ou inhibant l’expression de la clathrine (Clathrin KD). Les cellules sont ensuite traitées avec la Bafilomycin A1 (BafA1) qui inhibe la fusion des autophagosomes avec les lysosomes ce qui permet de quantifier la production d’autophagosomes. Les points vert/jaune représente les autophagosomes. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2923063/

**Formation et maturation d’un autophagosome. L’autophagosome se forme par le développement d’une membrane d’isolement. La nucléation de cette membrane dépend de l’action de deux complexes, le complexe ULK1 et le complexe phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PI3K). Ensuite, l’élongation de l’autophagosome nécessite la conjugaison de LC3 à la phosphatidyléthanolamine, une forme appelée LC3II. LC3 est présent dans la cellule dans un cytosolique soluble nommé LC3I. LC3I est d’abord clivé par la protéase Atg4, puis un système de conjugaison de type ubiquitine fait maturer cette forme clivée pour générer le LC3II. Dans ce système, Atg7 agit comme une enzyme E1, Atg3 comme une enzyme E2 et le complexe Atg5/Atg12/Atg16L comme une enzyme E3 de la cascade d’ubiquitinylation. Cette étape d’élongation permet l’expansion de la membrane initiale, séquestrant une partie du cytosol. L’autophagosome a la particularité d’avoir une double membrane. Au final, la membrane externe de l’autophagosome fusionne avec le lysosome pour former l’autolysosome. Après fusion, les enzymes lysosomales dégradent les protéines et autres substrats présents dans l’autolysosome. Chez les plantes et les levures, l’autophagosome fusionne avec la vacuole et non avec les lysosomes.

Pour initier la biogenèse des autophagosomes, plusieurs complexes ULK sont assemblés et l’ensemble fonctionne comme un échafaudage pour le recrutement d’autres protéines ATG. Le complexe ULK/ATG permet le recrutement et l’activation de complexes PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) qui permettent l’incorporation du phosphatidylinositol 3-phosphate (PIP3) dans les membranes à partir desquelles les autophagosomes sont générés. Ensuite, les protéines WIPI 1-4 se lient au PIP3 et recrutent les deux prochains composants importants de l’expansion des phagophores : les protéines ATG2 et le complexe ATG16L1 (Allmanai et al., 2022).

Il existe deux principaux types d’autophagie, qui diffèrent par le mode de séquestration des cibles à dégrader. Dans l’autophagie non sélective, les composants cytoplasmiques qui se trouvent sur les sites de formation des autophagosomes sont séquestrés de manière aléatoire. En revanche, dans l’autophagie sélective, certaines molécules, structures et organites sont reconnus par des protéines spécifiques appelées « récepteurs de l’autophagie » et sont sélectivement engloutis par les autophagosomes.

La biogenèse des autophagosomes est induite par une grande variété de signaux provenant de l’intérieur et de l’extérieur des cellules, notamment le manque de nutriments et d’ions (acides aminés, glucose, fer, zinc, phosphate, etc.), différents types de stress (stress du réticulum endoplasmique (RE), stress oxydatif, stress hypoxique, dommages à l’ADN, etc.), la formation d’agrégats protéiques anormaux ou d’organites endommagés et l’infection microbienne. Ces signaux sont transmis via différentes voies de signalisation, mais beaucoup d’entre eux convergent vers l’inactivation du complexe TORC1.

Tant que TORC1 est actif, l’initiation de l’autophagie est inhibée par sa phosphorylation des protéines ULK et ATG13. Lorsque TORC1 n’est pas activé (dans les conditions vues au paragraphe précédent), ULK et ATG13 ne sont plus phosphorylés et l’assemblage de la membrane d’isolement peut commencer.

**L’initiation de la formation d’un autophagosome nécessite l’inhibition du complexe TORC1. Source : https://www.nature.com/articles/s41580-020-0241-0

Des études dans les cellules souches musculaires adultes (les cellules satellites) ont montré que l’inhibition de TORC1 par la rapamycine peut activer l’autophagie et éviter la sénescence liée à l’âge dans ces cellules souches (Garcia-Prat et al., 2016). Si on élimine l’expression d’Atg7 dans ces cellules et donc on inhibe l’autophagie, il y a une augmentation de la sénescence et une chute importante du nombre de cellules satellites par fibre musculaire.

**L’autophagie est nécessaire dans les cellules satellites pour éviter d’entrer en sénescence. On détecte par immunofluorescence des cellules satellites Pax7+ dans les fibres musculaires de souris sauvages (Atg7^WT) et des souris où le gène Atg7 a été délété dans les cellules satellites grâce au système Cre-Lox (Atg7^ΔPax7). On observe une chute importante du nombre de cellules satellites par fibre musculaire. Des cellules satellites isolées des différentes souris sont soumis au test de sénescence SA-β-gal (activation de l’expression de la β-galactosidase par la sénescence) qui donne une coloration bleu en présence du substrat Xgal lorsque la sénescence est activée. On remarque que cette sénescence est plus importante en absence d’Atg7 et donc d’autophagie. Source : https://www.nature.com/articles/nature16187

Une fois l’autophagosome formé, il doit fusionner avec les lysosomes. Les protéines GABARAP recrutent la forme palmitoylée de PI4KIIα, une lipide kinase qui génère le phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P). L’inhibition de GABARAP ou de PI4KIIα, ou la surexpression d’un mutant PI4KIIα dominant négatif, diminue le flux d’autophagie en bloquant la fusion autophasome:lysosome, ce qui entraîne l’accumulation d’autophagosomes anormalement grands (Wang et al., 2015).

Les protéines SNARE sont également essentielles à la fusion autophagosome:lysosome. Les protéines SNARE sont des protéines membranaires qui se lient à la membrane soit par leur domaine transmembranaire situé à l’extrémité C-terminale, soit par des chaînes carbonées hydrophobes associées à des résidus cystéine. Les protéines SNARE sont classées selon une séquence au centre de leur domaine SNARE en R-SNARE et Q-SNARE (Fasshauer et al., 1998; Hong, 2005). Pendant la fusion, les R- et Q-SNARE des membranes en vis-à-vis forment un faisceau de quatre hélices α. L’énergie libérée lors du regroupement de ces complexes rapproche les membranes et permet le mélange lipidique et la fusion des membranes (Li et al., 2007). Plus précisément, dans le processus de fusion membranaire autophagosome-lysosome chez les mammifères, le premier ensemble de SNARE identifiés est constitué de STX17 (la syntaxine-17 de type Q-SNARE) sur la membrane autophagosomale, de SNAP29 (aussi de type Q-SNARE) et de VAMP8 (R-SNARE) sur la membrane lysosomale (Ikatura et al., 2012).

**Les autophagosomes s’accumulent et ne fusionnent pas avec les lysosomes en absence de la protéine de type SNARE Syntaxine-17 (STX17). Des cellules HeLa traitées avec un siARN ciblant la Luciferase (contrôle négatif) ou la Stx17 ont été cultivées dans un milieu pauvre en nutriments pendant 1 heure, suivies d’une analyse au microscope électronique à transmission. Les autophagosomes sont indiqués par des pointes de flèches rouge. Barres d’échelle = 500 nm. La quantification du nombre d’autophagosomes provenant d’au moins 25 régions sélectionnées au hasard est présentée dans le graphique. Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(12)01336-0

Le processus de fusion est également soutenu par les GTPases de type Rab (D’Agostino et al., 2017).

Très logiquement, la genèse de lysosomes et d’autophagosomes est souvent coordonnée. Le facteur de transcription à hélice-boucle-hélice/leucine zipper TFEB est un régulateur principal de la biogenèse des lysosomes et de l’autophagie. En conditions normales, TFEB subit une phosphorylation médiée par mTOR et reste dans le cytosol. L’action de facteurs de croissance ou la présence d’une quantité suffisante d’acides aminés active en effet mTOR qui inhibe l’autophagie en phosphorylant TFEB. Lorsqu’il y a pénurie de nutriments et que mTOR n’est plus activé ou lorsque les conditions de stockage dans les lysosomes deviennent saturées, TFEB est déphosphorylé puis est transloqué dans le noyau où il active ses gènes cibles via le système CLEAR (pour Coordinated Lysosomal Expression and Regulation). Contrairement aux activateurs purement autophagiques, TFEB favorise la clairance en régulant plusieurs étapes de la chaine de dégradation lysosomale-autophagique, notamment la formation de lysosome, la formation d’autophagosomes et la fusion autophagosome-lysosome (Sardiello et al., 2009, Song et al., 2021).

**Contrôle de l’activité du facteur de transcription TFEB et cibles de son activité. La localisation et donc l’activité de TFEB est contrôlée par le complexe mTOR, lui-même sous le contrôle de diverses molécules de signalisation. mTOR phosphoryle TFEB sur ses sérines 122, 142 et 211, ce qui empêche TFEB de rentrer dans le noyau. Signalons que ERK2 peut aussi directement phosphoryler TFEB et l’inactiver. Lorsqu’il est déphosphorylé, il peut y rentrer et activer la transcription de nombreux gènes dont les produits sont impliqués dans la formation des autophagosomes (les protéines Ag, LC3…) et des lysosomes (LAMP1…). Source : https://www.europeanreview.org/article/24875

**La phosphorylation sur la sérine 211 aboutit à l’interaction de TFEB avec la protéine cytoplasmique 14-3-3. Des cellules HeLa ont été transfectées avec des vecteurs permettant d’exprimer la TFEB sauvage couplée à la GFP (WT) ou des formes mutantes de TFEB (S142A = la sérine 142 remplacée par un acide aminé non phosphorylable, l’alanine et S211A = pareil pour la sérine 211). On réalise ensuite une immunoprécipitation sur des extraits protéiques de ces cellules avec un anticorps anti-GFP puis on analyse les protéines précipitées par western-blot (avec des anticorps anti-14-3-3, anti-PhosphoTFEB et anti-TFEB). Une analyse par western-blot des extraits protéiques totaux (lysate) permet de vérifier que des quantités similaires de protéines est présente dans tous les cas. On constate que si la sérine 211 n’est pas phosphorylée, il n’y a pas d’interaction avec 14-3-3. Des études complémentaires montrent que c’est cette protéine qui retient TFEB dans le cytoplasme lorsque TFEB est phosphorylé sur la sérine 211 par mTOR. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3437338/

La rapamycine qui inhibe mTOR stimule l’autophagie, ce qui contribue à éliminer les agrégats de protéines intracellulaires qui s’accumulent dans de nombreuses maladies neurodégénératives et à réduire leur toxicité (Menzies et al., 2015).

Des perturbations de l’autophagie participent aux mécanismes du vieillissement. Une grande partie des cellules souches hématopoïétiques (HSC) âgées présentent des niveaux d’autophagie diminués. Cela entraîne l’accumulation de mitochondries, ce qui à son tour induit un stress métabolique. Des niveaux élevés d’espèces réactives de l’oxygène, générées par les mitochondries, s’accumulent dans les HSC et compromettent leur fonctionnement (Ito et al., 2006, Mohrin et al., 2016). Chez les végétaux comme Arabidopsis thaliana, des mutants avec une perte-de-fonction de l’autophagie ont des feuilles qui subissent un vieillissement acceléré. La dégradation autophagique des chloroplastes, appelée chlorophagie, élimine les chloroplastes âbimés par les UVB ou une forte intensité de lumière dans le visible (Izumi et al. 2017, Nakamura et al. 2018).

**Un défaut d’autophagie affecte la croissance et la survie des parties aériennes de la plante, notamment en présence d’UVB. Des plants d’Arabidopsis thaliana sauvages (WT) ou mutants perte-de-fonction pour des gènes importants pour l’autophagie (atg5, atg7, atg2) sont mis à pousser pendant 7 jours puis pendant 3 ou 5 jours on les soumet chaque jour à 1h d’exposition aux UVB avec l’intensité indiquée. Le poids des parties aériennes est pesé; Source : https://academic.oup.com/plcell/article/29/2/377/6099114

Des perturbations de l’autophagie sont observées dans de nombreuses pathologies. Par exemple dans la maladie d’Alzheimer, les autophagosomes n’arrivent pas à fusionner avec les lysosomes ce qui crée un engorgement (Whyte et al., 2016). Ces dysfonctionnements peuvent précéder de plusieurs années l’apparition des symptomes de la maladie d’Alzheimer (Cataldo et al., 2000).

**Modifications des compartiments endo-lysosomal et autophagique dans la maladie d’Alzheimer. Dans un contexte physiologique normal (a), les endosomes se forment (i), reçoivent des enzymes lysosomales provenant des vésicules à MP6R dérivées de l’appareil de Golgi (ii) et finissent par fusionner ou mûrir en lysosomes (iii) où les molécules sont détruites par hydrolyse. Des matériaux à détruitre proviennent également des autophagosomes (iv) et des endosomes. Dans la maladie d’Alzheimer (b), l’endocytose est élevée (i) et une augmentation de la quantité de M6PR est trouvée dans le réseau endosomal (ii). Ceci s’accompagne d’une augmentation de la cathepsine D dans les endosomes précoces. L’augmentation de l’endocytose provoque une accumulation de molécules endosomales (iii) et une fonction lysosomale réduite provoque une accumulation d’autophagosomes non fusionnés avec des lysosomes (iv). Les lysosomes eux-mêmes accumulent davantage de contenus non dégradés. Source : https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jnc.13935

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