La superfamille TGFβ et ses voies de signalisation

Par Patrick Pla, Université Paris-Saclay

La famille des ligands de type TGFβ et les voies de signalisation associées jouent un rôle fondamental dans de multiples processus cellulaires au cours du développement embryonnaire. Le rôle d’un seul membre de cette famille est souvent multiple (effets pleïotropiques) selon le principe général que les voies de signalisation sont souvent réutilisées de multiples fois au cours du développement dans des localisations différentes. Il faut les considérer comme des modules dont les entrées et les sorties dépendent largement du contexte.

TGFβ

Après sécrétion par les cellules productrices, les ligands TGF-β (qui sont associés en homodimères) sont en majorité présents sous une forme latente car associés à la protéine LAP. Une interaction avec des intégrines (αvβ8 ou αvβ6 par exemple) permet à TGF-β de prendre sa conformation active, de quitter LAP et de s’associer à ses récepteurs (Brown et Marshall, 2019).

**Une forme inactive de TGF-β est secrétée par les cellules et doit être activée dans la matrice extracellulaire. Les TGF-β sont synthétisés sous forme de précurseurs contenant une région propeptide en N-terminale par rapport à la séquence « active ». Après leur synthèse, les TGF-β forment un homodimère qui interagit avec un peptide LAP (pour peptide associé à la latence), une protéine dérivée de la région N-terminale du produit du gène TGF-β, formant un complexe appelé petit complexe latent (SLC). Ce complexe reste dans la cellule jusqu’à ce qu’il soit lié par une autre protéine appelée Latent TGF-β-Binding Protein (LTBP), formant un complexe plus grand appelé Large Latent Complex (LLC). C’est cette LLC qui est sécrétée dans la matrice extracellulaire. Une interaction avec des intégrines ou l’action de la thrombospondine-1, ou des MMP (métalloprotéases) ou des espèces réactives de l’oxygène (ROS) aboutit à libérer l’homodimère TGF-β actif de ce complexe. Source : https://www.nature.com/articles/nrrheum.2014.137

La signalisation TGF-β passe par deux types de récepteurs transmembranaires à activité sérine-thréonine kinase. La liaison du ligand au récepteur au TGF-β de type II (TβRII) stabilise la formation d’un complexe avec le récepteur au TGF-β de type I (TβRI) et induit l’activation du récepteur TβRI par la kinase du récepteur TβRII.

**Activation des récepteurs TGFBR par le ligand TGF-β et activation de SMAD. TGF-β se lie au récepteur au TGF-β de type II (ici TGFBR2) ce qui active son activité sérine/thréonine kinase. TGFBR2 phosphoryle le domaine GS (riche en glycine et sérine) du récepteur au TGF-β de type I (ici TGFBR1) ce qui active à son tour le domaine sérine/théronine kinase de celui-ci qui phosphoryle l’une des protéines SMAD (SMAD2 ou SMAD3) sur des sérines C-terminales incluses dans un motif SXS (où X peut être n’importe quel acide aminé). Source : https://atlasgeneticsoncology.org/gene/372/tgfbr2-%28transforming-growth-factor-beta-receptor-ii-%2870-80kda%29%29

Les SMADs agissent ensuite comme effecteurs de signalisation. La phosphorylation C-terminale de SMAD2 ou SMAD3 par TβRI entraîne un changement de conformation qui favorise l’hétéromérisation avec SMAD4 et stimule la translocation nucléaire des complexes SMAD. Dans le noyau, les protéines SMAD régulent la transcription en se liant à l’ADN et en interagissant avec d’autres facteurs de transcription.

*Voie de signalisation de TGF-β. La fixation du ligand aux récepteurs provoque une cascade de phosphorylation qui aboutit à l’association de SMAD2/3 (de la famille des R-SMAD) avec SMAD4 et l’entrée de ce complexe dans le noyau où il se fixe à l’ADN et stimule la transcription de gènes cibles. Il existe des SMAD inhibiteurs comme SMAD7 qui sont en compétition avec les R-SMAD pour se fixer sur le récepteur TGFBR1. Source : https://www.mdpi.com/1422-0067/22/14/7575/htm

Cette interaction avec d’autres facteurs est nécessaire car les complexes SMAD ont une affinité faible ou nulle pour l’ADN. Phospho-SMAD3 associé à SMAD4 se lie directement à l’ADN avec une faible affinité au niveau d’éléments spécifiques de liaison à SMAD. Les complexes phospho-SMAD2-SMAD4, en revanche, ne se lient pas directement à l’ADN mais doivent s’associer à des facteurs de transcription, le premier caractérisé étant le facteur de transcription forkhead, FOXH1 (anciennement appelé Fast1) (Chen et al., 1996).

SMAD4 est essentiel dans la majorité des cas, mais n’est pas obligatoire dans certains contextes et une partie des gène-cibles de la voie de signalisation TGF-β est activée indépendamment de SMAD4. En effet, SMAD2/3 sont capables d’entrer dans le noyau sans SMAD4 (Fink et al., 2003). Par exemple, au cours du développement du pancréas, SMAD2/3, mais pas SMAD4, jouent un rôle clé (Bardeesy et al., 2006).

L’entrée des SMAD dans le noyau est contrôlée (entre autres) par l’Importine-8. Le gène qui code cette protéine, IPO8, a été retrouvé muté dans des patients atteints de symptômes proches du syndrome de Marfan (anomalies vasculaires et squelettiques). L’introduction de mutations équivalentes chez le poisson-zèbre a permis de reproduire des dysfonctionnements similaires à ceux des patients qui ont pu être reliés à un dysfonctionnement de la voie de signalisation TGF-β (et BMP également) (Ziegler et al., 2021).

La voie de signalisation TGF-β régule la différenciation mésenchymateuse, inhibant la différenciation des ostéoblastes, des myoblastes et des adipocytes.

*TGF-β inhibe la différenciation des myoblastes C2C12. (a,b) Les cellules C2C12 ont été induits à se différencier en milieu témoin (a) ou en milieu supplémenté en TGF-β (b). Les myotubes ont été colorés en immunofluorescence pour la chaîne lourde de myosine (CMH) (vert). Les noyaux ont été colorés au DAPI (bleu). La barre d’échelle indique 100 µm. (c,d) Indice de fusion, défini comme le nombre de myotubes avec ≥ 2 noyaux/nombre total de noyaux et l’indice de différenciation défini comme le nombre de noyaux dans les myotubes MHC+. Le nombre total de noyaux a été réduit par le traitement au TGF-β. (e,f,g,h,i) Dans les myoblastes et les myotubes, les niveaux de phosphorylation de SMAD2 (f,g) et de SMAD3 (h,i) vus par western-blot ont augmenté après 1 h de traitement au TGF-β. LY364947 est un inhibiteur du récepteur de TGF-β. Pan-actine sert de contrôle de chargement. Les niveaux de phosphorylation sont affichés sous forme d’intensité relative de pSMAD/SMAD total. Source : https://www.mdpi.com/2073-4409/9/2/375/pdf

C’est SMAD3, et non SMAD2, qui médie cette inhibition par le TGF-β de la différenciation des ostéoblastes et des myoblastes. Dans ce dernier cas, Smad3 interagit physiquement avec MyoD et perturbe sa liaison à l’ADN, réduisant ainsi l’expression génique spécifique au muscle. Dans l’inhibition de la différenciation ostéoblastique médiée par le TGF-β, SMAD3 réprime la fonction de CBFA1 sans perturber sa liaison à l’ADN.

C’est encore SMAD3 qui inhibe la différenciation adipocytaire en aval de TGF-β. L’adipogenèse, activée par C/EBPβ ou C/EBPδ, est inhibée par TGF-β sans diminution des niveaux de protéine C/EBP. Les C/EBP interagissent physiquement à la fois avec SMAD3 et SMAD4, et cette interaction est corrélée à la répression de la transcription médiée par C/EBP au niveau des promoteurs des gènes codant des protéines essentielles pour la différenciation adipocytaire, avec des sites de liaison C/EBP multimérisés. Mais l’action de SMAD3 et SMAD4 n’affectent pas la liaison de C/EBP à ces séquences cibles. Ces données représentent le premier exemple d’inhibition directe de la fonction de transactivation d’un facteur de transcription par SMADs (Choy et Derinck, 2003).

D’une manière générale, la signalisation TGF-β a une fonction pro-matrice extracellulaire (MEC). Elle favorise le dépôt net de la matrice en augmentant l’expression de composants spécifiques de la MEC tels que la fibronectine et le collagène, en activant l’expression des inhibiteurs des protéases de la MEC tels que l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène-1 (PAI-1) et les inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases matricielles (TIMPs), tout en diminuant l’expression des protéases qui dégradent les composants de la matrice, comme la collagénase interstitielle.

**L’induction de l’expression de la fibronectine par TGF-β nécessite l’activation de la kinase JNK. (A) L’induction de l’expression de la fibronectine après stimulation par le TGF-β a été testée dans des cellules BAHgpt (une lignée de fibrosarcome humain) transfectées avec un vecteur d’expression vide ou permettant d’exprimer JNKDN (une forme dominante-négative de JNK1), MKK4DN (une forme dominante-négative de MKK4 (MKK4 est un activateur de la voie JNK) et p38DN (une forme dominante-négative de p38) par western-blot. (Il manque un contrôle de dépôt à ce western-blot). Source : https://www.embopress.org/doi/full/10.1093/emboj/18.5.1345

Comme nous le voyons sur la figure ci-dessus, l’activation de l’expression de la fibronectine passe par une voie de signalisation particulière, la voie de signalisation JNK. Une autre voie de signalisation, la voie p38 aboutissant à l’activation de ATF-2 et CREB ne semble pas impliquée (Hocevar et al., 1999).

Cette stimulation de la production de la MEC par TGF-β en fait un des acteurs majeurs de la fibrose où du tissu abîmé est remplacé généralement par des fibroblastes et de la MEC qui n’est pas fonctionnelle (Fragogiannis, 2020).

Dans certains contextes cependant, notamment cancéreux, la signalisation TGF-β peut au contraire stimuler la dégradation de la MEC via l’activation de l’expression des métalloprotéinases, notamment MMP-9. TGF-β agit à ce moment-là non pas par les SMAD mais par l’intermédiaire de TAK1 (pour TGF-β activated kinase) qui agit à son tour sur JNK et p38 comme cela a été démontré dans des cellules tumorales de cancer du sein (Safina et al., 2007). TGF-β peut favoriser la progression tumorale en favorisant les transitions épithélio-mésenchymateuses (EMT).

*Changements d’expression protéiques qui accompagne l’EMT activée par le TGF-β. Des cellules A549 (cellules humaines épithéliales d’adénocarcinome alvéolaire) ont été exposées à 5 ng/mL de TGF-β pendant 0, 1, 2 et 3 jours. (A) Analyse par western-blot de l’expression de la E-cadhérine, de la N-cadhérine, de la vimentine, de la β-caténine et du facteur de transcription Snail. La β-actine a servi de témoin de charge ; (B–D) les niveaux de la protéine indiquée ont été quantifiés. Une version commentée de cette figure est disponible en vidéo.
Source : https://www.mdpi.com/2072-6643/9/9/980/htm

Outre l’activation de l’expression des coordinateurs majeurs de l’EMT, les facteurs de transcription de la famille Snail/Twist, les récepteurs TGF-β peuvent avoir un rôle plus direct : Par6, un régulateur de la polarité des cellules épithéliales et de l’assemblage des jonctions serrées, interagit avec les récepteurs TGF-β et est phosphorylée par le récepteur de type II, TGF-βRII. La phosphorylation de Par6 est nécessaire pour l’EMT dépendant du TGF-β dans les cellules épithéliales de la glande mammaire et contrôle l’interaction de Par6 avec l’ubiquitine ligase E3 Smurf1. Smurf1, à son tour, cible la petite GTPase RhoA pour la dégradation, entraînant ainsi une perte de jonctions serrées (Ozdamar et al., 2005).

**Action directe des récepteurs TGF-β sur Par6 qui se répercute sur la dégradation de RhoA qui contrôle la polarité des cellules épithéliales. L’activation des récepteurs par le ligand TGF-β aboutit (entre autres) à la phosphorylation de Par6 qui permet de recruter Smurf qui est une E3-ubiquitine ligase. Smurf ubiquitinyle RhoA ce qui provoque sa dégradation. Source : https://www.science.org/doi/10.1126/science.1105718

Dans d’autres contextes, TGF-β peut avoir une action anti-tumorale. Dans un type particulier de cancer du colon, on peut ainsi trouver des mutations du récepteur de TGF-β qui le rendent inactif et la signalisation TGF-β ne peut plus exercer son action modératrice sur la prolifération des cellules de carcinome du colon.

**Une mutation qui tronque le récepteur au TGF-β est associée à certains types de cancer du colon. Le récepteur TGF-β de type II (TGF-βRII) est fréquemment inactivé dans certains types de cancers du côlon. Dans l’ADN qui a été séquencé ici, les deux derniers adénines (en gras) ont été délétées et le
cadre de lecture lors de la traduction s’en trouve décalé. Il s’agit d’une mutation non-sens qui cause une fin prématurée de la traduction à cause de la présence d’un codon STOP dans le nouveau cadre de lecture. Le récepteur tronqué perd son domaine de signalisation intracellulaire C-terminal qui est crucial pour sa fonction. Cette perte permet aux cellules du carcinome du côlon de devenir résistantes aux effets inhibiteurs de croissance du TGF-β. Source : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9872311/

BMP

Les membres de la famille BMP (pour Bone Morphogenetic Protein) se distinguent des autres membres de la superfamille TGF-β en ayant sept (plutôt que neuf) cystéines conservées dans la protéine mature. Ils ont été d’abord caractérisés par leur capacité à faire différencier les ostéoblastes en ostéocytes mais leurs fonctions sont très variées. Signalons que malgré son nom, BMP1 est à part dans la famille, et est une protéase.

En général, les BMP agissent en tant qu’homodimères mais des hétérodimères ont aussi été caractérisés (Hazama et al., 1995; Bi et al., 2013). Les BMP de classe I, notamment BMP2 et BMP4, sont capables de s’hétérodimériser avec les BMP de classe II telles que BMP5, BMP6, BMP7 et BMP8 (Guo et Wu, 2012). Les hétérodimères formés entre les BMP de classe I et de classe II présentent une activité plus élevée que les homodimères de l’une ou l’autre des classes, probablement en raison de l’assemblage de complexes récepteurs différents.

**La différenciation des ostéoblastes murins (cellules MC3T3-E1) est stimulée par des hétérodimères BMP2/BMP7
Des pré-ostéoblastes sont soumis pendant 28 jours aux différents traitements indiqués puis une coloration rouge alizarine qui met en évidence la matrice extracellulaire osseuse (marqueur d’une différenciation des pré-ostéoblastes en ostéoblastes) est effectuée. ATRA = Acide rétinoïque tout-trans, une molécule impliquée dans la résorption osseuse et l’ostéoporose. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0078198

Les voies de signalisation activées ressemblent à celles de TGF-β mais ce sont les SMAD-1, -5 et -8 qui sont activées et non pas les SMAD-2 et -3. SMAD4 est toujours impliqué.

*Voie de signalisation BMP. La fixation du ligand sur les récepteurs aboutit à une phosphorylation des récepteurs de type I par les récepteurs de type II. Puis les récepteurs de type I phosphorylent sur des sérines les R-Smad (Smad1, Smad5 et Smad8). Ceux-ci s’associent alors à Smad4 et rentrent dans le noyau et se fixe sur l’ADN sur des séquences spécifiques appelées BRE = BMP Response Element. La transcription des gènes-cibles est alors activée.
Une version commentée en détail de cette figure est disponible en vidéo. Source

Chez la drosophile, l’orthologue des BMP s’appelle dpp (pour decapentaplegic). Dpp se lie au récepteur de type I Tkv et au récepteur de type II Punt pour phosphoryler le facteur de transcription Mad. Mad phosphorylé (pMad) forme un complexe avec le Co-Smad (Medea) pour s’accumuler dans le noyau et activer ou inhiber la transcription du gène cible.

Les BMP sont fortement impliqués dans la mise en place de l’axe dorso-ventral et antéro-postérieur chez les Vertébrés.

*L’inhibition de l’expression de Bmp2, Bmp4 et Bmp7 par des morpholinos antisens inhibe la phosphorylation endogène de Smad1 et provoquent une dorsalisation et des troncatures postérieures des embryons de xénope. (A) Conception des morpholinos (MO) antisens Bmp4, Bmp7 et Bmp2 qui ciblent le codon de démarrage de la traduction dans les deux pseudoallèles exprimés dans l’espèce subtétraploïde X. laevis. (B) La traduction in vitro en présence d’acides aminés marqués au S³⁵de Bmp4, Bmp7 et Bmp2 est spécifiquement inhibée par les MO respectifs. (C) Les MO pour Bmp2, Bmp4 et Bmp7 (à 12 ng chacun) ont été injectés seuls ou en combinaison dans les 4 blastomères d’un embryon de xénope. (D) La phosphorylation de Smad1 dans les embryons de stade 11 est diminuée par la co-injection de plusieurs MO de Bmp. (E-H) Les embryons injectés par Bmp4 MO (F) sont dorsalisés avec des têtes élargies (comparer avec les embryons de contrôle, E). Les pointes de flèches rouges délimitent le marqueur de la moelle épinière Hoxb9 (> 85 %, n = 60). (G) Le phénotype dorsalisé induit par le MO Bmp4 est sauvé par micro-injection de 100 pg d’ARNm Bmp4 de souris. (H) La microinjection d’ARNm de souris Bmp4 seul (100 pg) donne des embryons ventralisés avec de petites têtes, sans yeux et des structures de moelle épinière réduites (pointes de flèches rouges). (I-L) Les embryons déplétés en Bmp4 (J) se développent en têtards nageurs sans nageoires ventrales et avec des têtes légèrement plus grosses que les embryons témoins (I). Notez la position de l’anus, qui est déplacé (postériorisé) jusqu’au bout de la queue (tête de flèche blanche ; >72 %, n=61). (K) Les têtards déplétés en Bmp7 se développent avec une perte partielle de la nageoire ventrale et un anus postérieur (tête de flèche blanche ;> 79 %, n = 51). (L) La double déplétion de Bmp4 et Bmp7 se traduit par des têtards dépourvus de structures de queue (> 90 %, n = 39). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/132/15/3381/52502/Depletion-of-Bmp2-Bmp4-Bmp7-and-Spemann-organizer

*Phosphorylation différentielle de Smad1/5 selon l’axe dorso-ventral lors de la gastrulation chez le poisson-zèbre. Des embryons de poisson-zèbre sauvage (CTRL) ou muté n’exprimant plus SMAD4 (MZsmad4a) à 40% d’épibolie sont fixés puis traités en immunofluorescence avec des anticorps reconnaissant les formes phosphorylées de SMAD1 et 5 (vert) et avec du DAPI reconnaissant l’ADN (violet). Le côté dorsal est à droite. On constate un gradient d’activité de la voie BMP plus important du côté ventral et une diminution progressive vers le côté dorsal. SMAD4, auquel les formes phosphorylées de Smad1 et 5 s’associent doit être présent. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26486-3

SMAD4 est commun entre la voie des BMP et la voie de Nodal (voir plus loin pour la voie Nodal). Chez le poisson-zèbre, BMP a besoin de SMAD4 en aval pour activer correctement ses gènes cibles alors que Nodal peut quand même activer ses propres gènes cibles via des voies de signalisation de compensation (Guglielmi et al., 2021).

**SMAD4 est nécessaire à l’activation par BMP de ses cibles mais pas pour Nodal. Des embryons de poisson zèbre sauvages et mutants (MZsmad4a) n’exprimant plus SMAD4 ont été soumis à une analyse transcriptomique RNAseq et les gènes ont été classés selon qu’ils sont des cibles de la voie de signalisation BMP ou des cibles de la voie de signalisation Nodal. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26486-3

Les ligands BMP peuvent être piégés dans l’espace intercellulaire et empêchés d’agir sur leurs récepteurs par diverses protéines sécrétées : Chordine, Noggin, Follistatine et Gremlin. Cette inhibition a des fonctions très importantes lors de la mise en place des axes, pour le maintien de la croissance du bourgeon de membre (Zuniga et al., 1999), pour le contrôle de l’apoptose interdigitale, la transition épithélio-mésenchymateuse des crêtes neurales (Sela-Donenfeld et Kalcheim, 2000) ou lors de la formation du cortex (Ichinose et al., 2021).

*Gremlin est nécessaire à la bonne formation des couches internes du cortex. Le cortex d’embryons de souris à E20,5 est fixé puis observé en coupes en immunofluorescence avec un anticorps reconnaissant les formes phosphorylées de SMAD1/5/8 (activées par BMP) et un anticorps reconnaissant Ctip2, un marqueur des couches internes V/VI du cortex. Les souris sont soit Grem1^flox/flox (mais sans Cre recombinase) soit Grem1^cKO, c’est à dire avec une délétion des 2 allèles codant Gremlin1 par une Cre exprimée dans le cortex. On constate que sans Gremlin1, la voie BMP est anormalement activée dans les couches V/VI du cortex et cela a pour conséquence une épaisseur plus faible de ces couches (vue sur coupe avec coloration de Nissl). Barres d’échelle = 100 µm. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/148/14/dev195883/270850/The-BMP-antagonist-gremlin-1-contributes-to-the

La signalisation BMP peut aussi être modulée à la hausse ou à la baisse par différents acteurs intracellulaires. Smurf1 est une E3 ubiquitine ligase qui active la dégradation des récepteurs aux BMP ainsi que de SMAD1/5 (Murakami et Etlinger, 2019). Le recrutement de Smurf1 peut être facilité par SMAD6 et SMAD7 qui peuvent également se fixer sur les récepteurs BMP activés de type I et bloquer la phosphorylation des SMAD1/5/8 (Yan et al., 2009).

Bambi a, quant à lui, une structure très proche des récepteurs de type I de BMPR, mais a un domaine intracellulaire raccourci, sans aucune activité sérine/thréonine kinase. Il s’agit donc d’un pseudo-récepteur, qui joue un rôle de dominant-négatif en bloquant les interactions entre les récepteurs de type I et de type II (Ornichtchouk et al., 1999). Bambi bloque non seulement la signalisation BMP, mais aussi TGF-β et Nodal. Bambi interagit en plus avec le récepteur aux Wnt, Frizzled et aussi avec son effecteur Dishevelled et il facilite leur interaction, ce qui facilite l’activation de la voie canonique Wnt/β-caténine (Lin et al., 2008). On voit donc que Bambi inhibe la voie de signalisation BMP (et apparenté) pour activer une autre voie de signalisation concurrente, Wnt.

La calcineurine qui est une phosphatase activée par les ions Ca²⁺ est capable de déphosphoryler SMAD1/5 et donc d’inhiber la voie de signalisation BMP. Ce rôle a été démontré en aval des FGF qui activent une voie de signalisation menant à une augmentation de Ca²⁺ cytoplasmique et donc à l’activation de la calcineurine dans le futur tissu neural chez la souris (Cho et al. 2014). Ainsi, les FGF contribuent à l’induction neurale (en plus de Chordine et de Noggin qui capturent les BMP avant qu’ils n’atteignent leurs récepteurs).

FHL3 est, au contraire, une protéine qui facilite la signalisation BMP en stimulant la fixation des complexes SMAD1/5/8-SMAD4 sur les séquences régulatrices de ses gènes-cibles. Le gène codant Wnt8 est ainsi plus fortement activé en aval de la signalisation BMP en présence de FHL3 et cela permet de mieux induire de la bordure neurale dans un premier temps puis de mieux spécifier les cellules de crêtes neurales dans un deuxième temps (Alkobtawi et al., 2021).

**FHL3 renforce la signalisation BMP deux fois lors de la formation des cellules de crêtes neurales. Au stade jeune neurula, FHL3 renforce la signalisation BMP dans le mésoderme paraxial ce qui permet d’augmenter l’expression de Wnt8 qui diffuse vers la bordure neurale sus-jacente et induit l’expression de gènes importants pour la formation des cellules de crêtes neurales. Plus tard, au stade neurula âgée, FHL3 renforce à nouveau la signalisation BMP dans la bordure neurale ce qui permet de produire à nouveau plus de Wnt8 qui par un mécanisme autocrine favorise la spécification des crêtes neurales. Dans les 2 cas, FHL3 interagit directement avec le complexe SMAD1/5/8/SMAD4 et facilite sa fixation sur le promoteur de Wnt8. NB = bordure neurale ; NC = crêtes neurales; NP = plaque neurale.

SMAD1/5/8 peuvent avoir des fonctions indépendantes de SMAD4. Notamment, ils peuvent se fixer sur le complexe Drosha et accélérer la maturation de pri-miARN en microARN. C’est le cas pour le microARN miR-21 qui contrôle la différenciation des cellules musculaires lisses de la paroi des vaisseaux sanguins sous le contrôle des BMP.

**BMP4 active la maturation des précurseurs du miARN miR-21 en provoquant la liaison de SMAD1/5 avec le complexe Drosha (b) Des cellules musculaires lisses ont été transfectées avec des siRNA de contrôle (Control-siRNA) ou des siRNA contre p68 (p68-siARN) p68 est un composant du complexe Drosha qui participe au processus de maturation des pri-miARN en pré-miARN (qui deviennent ensuite des microARN). L’expression de pri-miR-21, pré-miR-21 et miR-21 mature a été examinée après un traitement de 2h avec BMP4. (c) Extraits nucléaires préparés à partir de cellules traitées avec BMP4 (2h) et soumis à une immunoprécipitation avec des anticorps anti-p68, anti-DROSHA, ou IgG non spécifique (contrôle), suivi d’une immunodétection sur western-blot avec anti-SMAD1/5, anti-p68 ou anti-DROSHA. Le signal des anticorps anti-lamine A/C sert de contrôle. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2653422/pdf/nihms-95861.pdf

Nodal

Les ligands de la famille Nodal empruntent en partie les mêmes voies que la signalisation TGFβ. Cependant, les récepteurs, les gènes cibles et les interactants régulateurs sont différents.

**Production, maturation de Nodal et voies de signalisation activées par Nodal. Les niveaux d’expression de Nodal sont affectés par l’activité de la super-famille miR-430. Une fois la protéine traduite, elle doit être traitée dans l’espace extracellulaire par des convertases (Furine et PACE4). L’interaction de Nodal avec les BMP (BMP3, BMP7), Lefty ou avec Cerberus à l’extérieur des cellules affecte sa capacité à se lier aux récepteurs. Nodal se lie aux récepteurs I et II de l’Activine et au co-récepteur Cripto/Criptic qui phosphorylent Smad2 /3 (comme TGFβ). Ces Smads forment un complexe avec Smad4 et entrent dans le noyau et avec l’aide de p53, Mixer ou FoxH1 activent la transcription des gènes (notamment ceux impliqués dans l’induction du mésoderme et de l’endoderme). Ectodermine, PPM1A, XFDR et Tgf1 inhibent la voie en entrant en compétition avec les composants de Smad ou les facteurs de transcription. Notez que Nodal et son répresseur Lefty peuvent tous deux exprimés en réponse à la signalisation Nodal, ce qui provoque des rétroactions positives ou négatives.
Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Nodal_signaling_pathway#/media/File:Nodal_signaling.jpg

L’activine et Nodal partagent les mêmes récepteurs et activent les mêmes voies de signalisation. Souvent, on utilise l’activine plutôt que Nodal comme ligand pour des cultures in vitro car elle est plus facile à produire en tant que protéine recombinante.

La protéine Lefty est un antagoniste de Nodal et elle agit de 2 manières : en se fixant sur Nodal directement et en se fixant au co-récepteur Cripto et en empêchant l’interaction de Nodal avec lui de manière compétitive. Le gène codant Lefty est une cible de la voie de signalisation Nodal ce qui en fait un exemple classique de rétroaction négative. Les souris mutantes Lefty2^-/- et les poissons-zèbres mutants perte-de-fonction pour Antivin (l’orthologue de Lefty) produisent trop de mésoderme et ont une ligne primitive trop étendue en conséquence d’une suractivation de la voie Nodal (Meno et al., 1999).

**Sans rétroaction négative de Lefty, la voie Nodal génère une ligne primitive et un mésoderme hypertrophiés. Coupes transversales de gastrulas de souris sauvages (L, M) ou mutants Lefty2^-/- (I, J). J et M sont des agrandissements des régions indiquées en I et L. ect = ectoderme; mes = mésoderme; ps = ligne primitive et ve = endoderme viscéral. Source : https://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(00)80331-7.pdf

La signalisation Nodal est fortement active dans les cellules souches pluripotentes (ES ou iPS) en culture et est nécessaire au maintien de leurs propriétés. La différenciation de ces cellules s’accompagne souvent d’une baisse de la signalisation Nodal, liée entre autre à l’activation de l’expression de Lefty. Dans les cellules souches pluripotentes, l’expression de Lefty est réprimée par un microARN, miR-302. Si on surexprime ce microARN, l’expression de Lefty est plus faible que normalement et les cellules mettent plus de temps à se différencier. L’expression des gènes de pluripotence Nanog, Oct4 et Sox2 met plus de temps à s’éteindre (Barroso-DelJesus et al., 2011).

La voie de signalisation Nodal est essentielle pour mettre en place l’asymétrie droite-gauche. Elle est activée par un flux de liquide extracellulaire contrôlé par des battements ciliaires vers la gauche au sein de l’organisateur droite-gauche qui se trouve dans le plan de symétrie bilatérale et qui est dérivé du nœud de Hensen. La pression exercée vers la gauche active des mécanosenseurs ciliaires qui contiennent des canaux cationiques Pkd2 nécessaires à la mise en place de la polarité droite-gauche (Pennekamp et al., 2002). S’ensuit une entrée de Ca²⁺ dans le cytoplasme qui active une cascade de transduction aboutissant à l’inhibition de l’inhibiteur de la voie Nodal, Dand5 (aussi appelé Cerl2). Les ARNm de Dand5 sont dégradés plus rapidement sous l’action de la protéine Bicc1 activée par le Ca²⁺ (Nakamura et al., 2012, Maerker et al., 2021). La voie de signalisation Nodal peut ainsi agir et activer la transcription de Pitx2 (Yoshioka et al., 1998).

Bien que présentée ici de manière séparée, les signalisations Nodal et BMP peuvent être inter-dépendantes. Par exemple dans l’embryon de souris, Nodal dérivé de l’épiblaste induit la synthèse de BMP4 dans l’ectoderme extra-embryonnaire qui à son tour favorise l’expression de Nodal dans l’épiblaste (Robertson, 2014).

Signalons que l’hormone anti-Müllerienne (AMH) produite dans les testicules par les cellules de Sertoli et qui provoque la régression du canal de Müller chez les embryons mâles est un ligand de la surperfamille des TGF-β. Des mutations dans le gène codant l’AMH ou les sous-unités de son récepteur peuvent provoquer une persistance de canaux de Müller chez des enfants mâles (Belville et al., 2002). Chez les femelles, après la naissance, l’AMH est secrétée par les cellules de la granulosa dans les follicules ovariens et limite le recrutement des follicules à partir de la réserve.

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