Croissance du tube pollinique et double fécondation chez les Angiospermes

Par Patrick Pla, Université Paris-Saclay

Aspects historiques

Les étamines sont considérées pour la première fois comme les organes mâles de la fleur par Grew (1682). Camerarius (1694) a remarqué qu’un mûrier femelle, à proximité duquel aucun plant mâle ne poussait, ne produisait que des graines stériles. Inspiré par cette observation, il la généralisa à d’autres espèces et en conclut que les anthères sont les organes sexuels mâles et l’ovaire, avec son
style, l’organe sexuel femelle. Kolreuter (1761) a réalisé plusieurs expériences sur la sexualité des plantes et a mis en évidence le rôle des insectes dans la pollinisation. Il a également remarqué que seuls les grains de pollen de la même espèce étaient efficaces pour la fécondation. Le mérite de la découverte du tube pollinique revient à Amici (1824), un mathématicien italien, astronome et fabricant de microscopes méticuleux. Il a conclu que le tube pollinique, après être sorti du grain de pollen, s’allonge petit à petit et entre finalement en contact avec les ovules, un tube pour chaque ovule. Le rôle du sac embryonnaire a donné lieu à une controverse entre Amici et Schleiden avec ce dernier qui pensait que l’embryon de la plante provenait exclusivement du développement de l’extrémité du tube pollinique. Amici a finalement démontré que l’ovule et en son sein le sac embryonnaire jouait un rôle fondamental, ce qui fut aussi confirmé par Hofmeister (1849).

Croissance et guidage du tube pollinique

En guise d’introduction, rappelons que le pollen est un petit gamétophyte mâle. Il se développe au sein des étamines, l’organe reproducteur mâle des Angiospermes, qui est généralement constituée d’un filament en forme de tige et d’une anthère. La formation des microspores haploïdes (microsporogénèse) et le développement du pollen (microgamétogenèse) ont lieu dans l’anthère.

Chez les Angiospermes, les gamétophytes mâles sont en général tricellulaires constitués de cellules végétatives qui contiennent une paire de spermatozoïdes. Les deux spermatozoïdes sont entourés par la membrane plasmique végétative interne, une endomembrane qui provient de la membrane plasmique de la cellule végétative hôte. Cela reflète l’internalisation du précurseur du spermatozoïde au cours de la gamétogenèse mâle.

**Formation des spermatozoïdes dans le grain de pollen des Angiospermes. La première mitose post-méiotique du microspore, appelée pollen mitosis I (PMI), est asymétrique : elle produit une grosse cellule végétative (VC) et une petite cellule générative (GC). L’asymétrie est initiée par polarisation du microspore et migration nucléaire vers le pôle où s’établira la petite cellule; le plan de division est ensuite décalé (excentré), donnant deux tailles cellulaires différentes. Le cytosquelette (actine + microtubules) orchestre la polarité, la position nucléaire et la formation du phragmoplaste. Immédiatement après la cytokinèse, la GC est entièrement incluse dans le cytoplasme de la VC, donc intracellulaire : on parle d’un modèle de cellule dans la cellule (cell-in-cell structure). Cette internalisation se produit par un processus d’endocytose contrôlée, médiée par le cytosquelette et la membrane plasmique de la VC. La spécification des destins cellulaires (VC vs GC) implique des régulateurs transcriptionnels et du cycle cellulaire : DUO1 est un facteur de transcription-clef pour l’identité du noyau génératif. Sous son contrôle, la cellule générative subit une deuxième mitose post-méiotique (MPII) générant deux spermatozoïdes. Source : https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-540-69161-7_1

Les grains de pollen sont libérés de l’anthère à l’état déshydraté (vie ralentie). Selon la stratégie de reproduction de la plante, le pollen est transporté par le vent (anémogamie), les insectes (entogamie), les oiseaux ou même les chauves-souris frugivores vers d’autres fleurs, où il adhère au stigmate, l’extrémité réceptive souvent visqueuse du ou des carpelles.

*Extrémité d’un stigmate de lis avec des grains de pollen collés dessus. Des grains de pollen (en jaune) sont collés sur la structure gélatineuse produite par la dégénérescence de cellules du stigmate qui se pigmentent en violet, progressivement. Source : https://phototheque.enseigne.ac-lyon.fr/photossql/photos.php?RollID=images&FrameID=stigmate_lis_pollen

Certaines espèces, comme Arabidopsis et le tournesol, ont des stigmates secs, et l’adhérence du pollen à la cellule papillaire stigmatique est assurée par des composants de l’exine pollinique. Néanmoins, dans tous les cas, il y a une réhydratation du pollen qui est nécessaire à son développement.

Après cette étape d’adhérence et de réhydratation, le grain de pollen reprend son métabolisme actif et émet le tube pollinique qui traverse les tissus du pistil pour atteindre l’ovule. Ce mode de fécondation par lequel un tube cellulaire apporte un gamète mâle jusqu’au gamète femelle s’appelle la siphonogamie (du latin sipho, «petit tube»).

Ce qu’on appelle l’unité germinale mâle est formée par un complexe de noyaux végétatifs et de spermatozoïdes. Après la germination du tube pollinique, l’unité germinale mâle est localisée dans la zone apicale du tube à environ 50–100 µm de l’extrémité et maintient la structure du triplet, gardant le noyau végétatif devant les spermatozoïdes.

**Développement du pollen et expression des gènes. Les grains de pollen génèrent de nombreux transcrits pour leur germination et la croissance du tube pollinique. Le pollen mature peut conserver de grandes quantités d’ARNm sous la forme de mRNP (ribonucléoparticules avec des ARNm) au repose (0 h). Lorsque les tubes polliniques sont prêts à germer, il y transcription de novo d’ARNm dans un court laps de temps. Dans le tube pollinique en germination, une activité réduite de dégradation de l’ARNm peut contribuer à l’accumulation d’une grande quantité de transcrits (0,5 h). Chez Arabidopsis, le premier bouchon calleux se forme à la partie basale du tube pollinique dans les 3 h suivant la germination. Une traduction locale à l’extrémité du tube pollinique contribue à la croissance active du tube pollinique (4 h). Source : https://www.frontiersin.org/journals/plant-science/articles/10.3389/fpls.2022.1020306/full

Durant sa croissance, le tube pollinique correspond à la cellule végétale qui s’allonge le plus rapidement (Sanati Nezhad et al., 2014) et chez Arabidopsis, la une vitesse de croissance peut atteindre 1 cm/h. Toute l’activité de croissance est restreinte au dôme apical du tube pollinique, ce qui fait que le tube pollinique est un modèle très étudié pour la régulation spatiale et temporelle de la croissance polarisée dans les cellules végétales. La croissance de l’extrémité du tube pollinique dépend de la pression de turgescence, du relâchement de la paroi cellulaire pour permettre l’expansion et d’un apport constant de matériaux de paroi cellulaire et de membrane pour l’incorporation à l’extrémité apicale.

À mesure que le tube pollinique se développe, son cytoplasme reste dans la zone située derrière l’extrémité apicale et des bouchons de callose se forment à intervalles réguliers pour obturer la partie restante du tube. Ces bouchons de callose sont produits par la callose synthase, dont le positionnement exact dépend des microtubules corticaux. La paroi des cellules polliniques est particulière et se divise en une paroi externe, composée principalement de pectines, et une paroi interne, contenant de la callose et de la cellulose, qui ne se dépose cependant qu’à une certaine distance de l’extrémité.

Les microfilaments d’actine sont essentiels à l’élongation rapide et polarisée des tubes polliniques. Leur perturbation par des inhibiteurs spécifiques (tels que la latrunculine B, la cytochalasine D ou un excès de profiline) entrave la croissance du tube pollinique (Vidali et al., 2001; Xu et al., 2020). La polymérisation de l’actine à l’extrémité du tube pollinique est une étape limitante de la croissance. Des protéines telles que les formines (par exemple, FH5) et les facteurs de dépolymérisation de l’actine régulent la nucléation et le renouvellement des microfilaments, établissant la structure d’actine subapicale nécessaire à la croissance efficace du tube (Cheung et al., 2010; Qu et al., 2017). Les protéines spécifiques de liaison à l’actine, comme CAP1, sont essentielles pour maintenir un approvisionnement en monomères d’actine compétents en polymérisation (Jiang et al., 2019).

**Microfilaments d’actine observés dans un tube pollinique de lys en croissance. L’anneau dense subapical de microfilaments d’actine qui est ici bien visible agit à la fois comme un filtre sélectif qui empêche les grands organelles de pénétrer dans cette zone et comme un réseau pour le transport des vésicules déplacés par la myosine, guidant l’apport de matière pour la membrane et la paroi cellulaire en croissance. Barre d’échelle = 10 µm. Source : https://www.osti.gov/pages/servlets/purl/2483278

Le dynamisme des microfilaments est sous le contrôle de GTPase de type Rho, ROP1 (Qin et Yang, 2011).

**ROP1 et le dynamisme de l’actine lors de la croissance du tube pollinique. Le réseau est composé de plusieurs voies favorisant de manière coordonnée l’exocytose à la pointe du tube pollinique et les boucles de rétroaction positives et négatives, qui peuvent s’équilibrer pour maintenir une certaine taille de la coiffe ROP1 apicale qui définit le domaine de croissance de la pointe. ROP1 est activé localement à la membrane plasmique ce qui active plusieurs voies menant à l’exocytose polaire. La voie RIC4 favorise l’assemblage de la F-actine et induit l’accumulation de vésicules exocytaires à la pointe, et favorise les boucles de rétroaction positives pour augmenter la zone d’activité de ROP1 en ciblant les composants en amont de ROP1 tels que RopGEF et PRK2. En parallèle, ROP1 active aussi RIC3 qui provoque une entrée de Ca²⁺ qui facilite l’exocytose tout en dépolymérisation les microfilaments qui ne sont plus utiles. Source : http://europepmc.org/article/MED/21729760

(Gauche) Image au microscope électronique à balayage du pistil d’A. thaliana. Le côté droit de la paroi de l’ovaire a été retiré pour montrer les ovules internes. (Droite) Schéma des structures de la fleur d’A. thaliana et du processus de guidage du tube pollinique à l’intérieur de l’ovaire. Une fleur possède un pistil au centre, formé par la fusion des carpelles. Les carpelles fusionnés forment deux loges, qui abritent chacune environ 20 à 30 ovules disposés verticalement à l’intérieur de la loge. La région fusionnée forme un septum abritant le placenta, d’où un funicule relie chaque ovule. Lorsque le pollen atterrit sur le stigmate, il forme un tube pollinique. Le tube pollinique pénètre à l’intérieur du stigmate et entre via le tissu de transmission (TT) dans l’ovaire. Ensuite, on peut diviser le guidage en 3 étapes : (1) sortie du tube pollinique du TT vers le septum épidermique, (2) guidage du tube pollinique de la surface du septum vers le funicule (guidage funiculaire) et (3) guidage du tube pollinique du funicule vers le micropyle (guidage micropylaire). Après le guidage micropylaire, le tube pollinique pénètre dans le micropyle de l’ovule et libère les spermatozoïdes dans les cellules synergides, puis une double fécondation avec l’ovule et la cellule centrale a lieu. Source : https://www.embopress.org/doi/full/10.1038/s44319-024-00151-4

La croissance du tube pollinique est directionnelle et répond à divers signaux de guidage dans le pistil. La réorientation de la croissance peut être obtenue in vitro en exposant les tubes polliniques en croissance à des déclencheurs placés de manière asymétrique tels qu’un ovule isolé (Yetisen et al., 2011) ou un sac embryonnaire nu (Higashiyama et al., 1998) ainsi que des sources localisées d’agents attractifs et répulsifs (Prado et al., 2004; Horade et al., 2012).

**Croissance préférentielle in vitro de tubes polliniques vers les ovules. Séquence d’images de la croissance du tube pollinique dans un microdispositif in vitro, avec des ovules dans la chambre gauche et une chambre droite vide, après une période d’incubation de (a) t = 0, (b), t = 4,5 h et (c) t = 18 h. On observe qu’une majorité de tubes polliniques s’orientent vers la gauche où se trouvent les ovules. Barre d’échelle = 200 μm. Source

*Guidage du tube pollinique vers les synergides du sac embryonnaire dans un système semi-in vitro. Le sac embryonnaire exposé de Torenia fournieri sécrète un facteur attractif qui guide le tube pollinique vers l’appareil filiforme situé entre les deux synergides. Le tube pollinique cible et pénètre la synergide. Les temps indiqués sont en minutes: secondes. Source : https://www.nature.com/articles/nature07882

Les expériences d’ablation confirment que les cellules synergides sont à la fois nécessaires et suffisantes pour l’attraction du tube pollinique vers le gamétophyte femelle. Les synergides sécrètent de petites molécules sous l’induction non cellulaire autonome des cellules centrales pour attirer les tubes polliniques. Chez les mutants (tels que ceux présentant un défaut dans le facteur de transcription MYB98 qui contrôle la fonction sécrétoire synergique), l’absence de sécrétion adéquate de facteurs attractifs conduit les tubes polliniques à ne pas trouver le micropyle, ce qui entraîne un échec de la fécondation (Mizuta et al., 2018). Les synergides sécrètent notamment des peptides appelés LURE qui sont perçus par des récepteurs à activité kinase exprimées dans les tubes polliniques, puis transduites vers des machineries de croissance intracellulaire telles que de petites GTPases et le cytosquelette, qui sont régulées par un gradient de Ca²⁺ (Krichevsky et al., 2007; Steinhorst et al., 2013).

Les barrières à la fécondation

*Image de microscopie électronique à balayage de la pollinisation chez Brassica montrant l’interaction entre un grain de pollen avec un tube pollinique en début de croissance (Po) et une cellule papillaire du stigmate (P). Source : https://academic.oup.com/plcell/article-abstract/14/suppl_1/S227/6009894

Environ 70 % des Angiospermes ont des fleurs hermaphrodites avec des organes mâles et femelles. On peut donc penser que l’autogamie est majoritaire. Ce n’est pas le cas.

En effet, les interactions pollen-pistil créent non seulement une série de barrières d’hybridation interspécifiques mais aussi peuvent restreindre la reproduction entre plantes d’une même espèce mais génétiquement trop proches (on parle alors d’auto-incompatibilité et c’est bien sûr un des freins majeurs à l’autofécondation chez les fleurs qui sont hermaphrodites). La surface des cellules du stigmate, qui sert de site récepteur aux grains de pollen est le point initial de détermination de la compatibilité. L’adhésion du pollen, son hydratation, sa germination, la pénétration du tube pollinique dans le stigmate et la croissance de ce tube dans le style, constituent d’importantes barrières.

*Inhibition de la croissance du tube pollinique
causée par le locus d’auto-incompatibilité S chez Brassica.
(a) Un tube pollinique S1/S2 ne présente aucune croissance sur un stigmate S1/S2. (b) Il y a croissance du tube pollinique dans un stigmate S1/S2
croisé avec un pollen S3/S4.

Des recherches chez les Brassicacées ont révélé que le récepteur kinase stigmatique du locus S (SRK) contribue au rejet du pollen intraspécifique et interspécifique via une signalisation dépendante de FERONIA (FER) qui active la production les espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Huang et al., 2023).

*FERONIA1 (FER1) est nécessaire au rejet des pollens d’espèces différentes ou de la même espèce mais génétiquement trop proches chez Brassica rapa. Coloration au bleu aniline de pistil de Brassica rapa mis en présence de grains de pollen de la même espèce compatibles (CP) ou incompatibles (SI) ou d’espèces différentes. Les pistils ont été traités au préalable avec une solution contrôle (Mock), ou contenant des oligonucléotides sens (contrôle, S-BrFER1) ou antisens (AS-BrFER1). Les oligonucléotides antisens inhibent la production de la protéine FER1. Source : https://www.nature.com/articles/s41586-022-05640-x

Chez Arabidopsis thaliana, STIGMATIC PRIVACY 1 (SPRI1), une protéine stigmatique, est impliquée dans l’établissement de l’incompatibilité interspécifique. Des découvertes récentes ont également montré que les peptides de classe B de la POLLEN COAT PROTEIN (PCP-B) portés par les PG compatibles sont reconnus par le récepteur stigmatique FER d’une manière spécifique à l’espèce, favorisant l’hydratation rapide du pollen conspécifique. Cependant, une hydratation brièvement retardée permet toujours la germination interspécifique du pollen et la pénétration/croissance des tubes, ne constituant donc pas une barrière stricte d’hybridation interspécifique/intergénérique.

Chez le pavot commun (Papaver rhoeas), le locus d’auto-incompatibilité du pistil code pour des protéines S de faible poids moléculaire qui déclenchent une voie de signalisation dépendant du Ca²⁺ dans le pollen incompatible. Il en résulte un arrêt rapide de la croissance du tube pollinique, une dépolymérisation de l’actine et l’activation d’une cascade de MAP kinases. Ces événements favorisent à leur tour l’apoptose, au cours de laquelle le cytochrome c miotchondrial s’échappe dans le cytosol, l’ADN est fragmenté et les métacaspases sont activées.

**Apoptose du tube pollinique chez les Papaveracées. L’interaction entre les deux partenaires de l’autoincompatibilité : PrsS (déterminant femelle) et PrpS (déterminant mâle) se fait à la surface du tube pollinique; la protéine pollinique SBP faciliterait cette interaction. Le complexe PrsS-PrpS contrôlerait l’activité de canaux calciques produisant l’entrée massive de calcium. Le calcium agit comme un messager secondaire provoquant : (i) la dépolymérisation rapide de l’actine, (ii) la phosphorylation de protéines cibles : P26, une protéine cytoplasmique présentant des homologies avec une pyrophosphatase et P56, une MAP kinase putative et (iii) l’activation de marqueurs d’apoptose comme des caspases. Source : https://www.biologie-journal.org/articles/jbio/pdf/2010/01/jbio2009046.pdf

Le gamétophyte femelle

Pendant le développement de la fleur, un seul mégasporocyte subit la méiose et donne en général naissance à un seul macrospore (ou mégaspore) mature (les 3 autres dégénèrent rapidement sauf dans certains groupes comme chez Allium (ail) où 2 macrospores se développent). Dans la mégaspore, il y a plusieurs mitoses qui donnent 8 noyaux haploïdes :

l’oosphère qui est le gamète
2 synergides
une cellule centrale à deux noyaux
3 cellules antipodales

*Sac embryonnaire (= gamétophyte femelle) chez les Angiospermes. Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Sac_embryonnaire#/media/Fichier:Sac-embryonnaire.png

*Développement du sac embryonnaire chez Arabidopsis. Vues en microscopie confocale. (A) La mégaspore (FMS) initie le développement du sac embryonnaire. (B) Sac embryonnaire (coloré en vert) à deux noyaux avec une grande vacuole centrale. (C) Sac embryonnaire à quatre noyaux. (D) Sac embryonnaire mature avec les synergides différenciées (SC, noyaux jaunes), l’oosphère (EC, noyau rouge), cellule centrale (CC, noyaux polaires bleus non fusionnés) et cellules antipodales (AC, seuls deux des trois noyaux colorés en violets sont visibles). it = tégument interne ; ot = tégument externe ; fc = funicule. Coloration artificelle pour montrer les structures. Source : https://www.uv.mx/personal/tcarmona/files/2010/08/Yang-et-al-2010.pdf

Déroulement de la double fécondation

Lors de la fécondation chez les Angiospermes, un noyau d’un spermatozoïde fusionne avec le noyau de l’oosphère pour former le zygote diploïde, qui se développe en embryon, tandis que le noyau de l’autre spermatozoïde fusionne avec les deux noyaux de la cellule centrale pour former un noyau triploïde,
à partir duquel se développe l’albumen (appelé endosperm en anglais), qui est un tissu de réserve.

Le sac embryonnaire sécrète des protéines (ex. ZmES4, une défensine-like) qui interagissent avec des canaux potassiques du tube pollinique. Cette interaction provoque un influx brutal d’ions K⁺ et d’eau, créant un déséquilibre osmotique qui rompt l’extrémité du tube pollinique, libérant les deux spermatozoïdes (Amien et al., 2010).

**ZmES4 est principalement localisée dans la zone sécrétoire des synergides du sac embryonnaire avant la fécondation
(A) Schéma du gamétophyte femelle (sac embryonnaire) du maïs, intégré dans les tissus maternels de l’ovule. Le tégument externe est noir, le tégument interne gris foncé et le nucelle gris clair. L’ovule (bleu-vert) est caché derrière les deux synergides et l’appareil filiforme est indiqué par une flèche blanche. (B) Micrographie fusionnée en fond clair et en UV montrant une vue oblique de la région micropylaire. Le tégument interne a été retiré. La protéine de fusion ZmES4-GFP, sous le contrôle du promoteur endogène, est localisée dans les cellules synergides, les signaux les plus forts étant situés autour de l’appareil filiforme (flèche). La flèche pointe vers les cinq à six empilements de cellules du nucelle micropylaires entourant l’appareil ovulaire. (C) Image UV améliorée de (B) montrant les signaux GFP les plus forts dans la zone sécrétoire des deux cellules synergides (flèches). Des vésicules sont visibles dans les extensions synergides de l’appareil filiforme (pointe de flèche). Des signaux plus faibles sont visibles dans la cellule centrale. Source : https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.1000388

Après une double fécondation réussie, les synergides aident à prévenir l’attraction de tubes polliniques supplémentaires en inactivant la libération des signaux attractifs, via les voies de signalisation incluant FERONIA (FER) et LORELEI (LRE).

Chez les Gymnospermes, il n’y a pas de double fécondation. Il n’y a, en effet, pas de fusion des noyaux mâle conduisant à la formation d’un endosperme triploïde. Le tissu de stockage dans la graine des Gymnospermes est haploïde et correspond au mégagamétophyte modifié.